HPLC法測(cè)定人肝細(xì)胞L02內(nèi)外液中金絲桃苷的含量Δ

幸海燕，夏培元，戴 青，陳劍鴻，孫鳳軍

（第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院國(guó)家藥品研究臨床藥理基地，重慶市 400038）

HPLC法測(cè)定人肝細(xì)胞L02內(nèi)外液中金絲桃苷的含量Δ

幸海燕＊，夏培元#，戴 青，陳劍鴻，孫鳳軍

（第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院國(guó)家藥品研究臨床藥理基地，重慶市 400038）

目的：建立測(cè)定人肝細(xì)胞L02內(nèi)、外液中金絲桃苷（Hyp）含量的方法。方法：以80μg·mL-1的Hyp與L02共孵育0、3、6、12、24h后，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)、外液中金絲桃苷的含量。色譜柱為KROMASIL C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸（45∶55），柱溫為30℃，流速為1.0mL·min-1，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm。結(jié)果：細(xì)胞外液中Hyp的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝35.412X－8.586（r＝0.9999），表明Hyp檢測(cè)濃度在2～200μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系；細(xì)胞內(nèi)液中Hyp的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y＝35.759X－7.422（r＝0.9999），表明Hyp檢測(cè)濃度在0.1～10μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。細(xì)胞外、內(nèi)液中Hyp的平均回收率分別為（96.00±2.43）%、（97.18±4.62）%，平均日內(nèi)RSD分別為1.98%、4.36%，平均日間RSD分別為1.75%、2.86%。樣品溶液處理后室溫放置22h，未處理樣品溶液于－20℃放置6d，平均RSD均＜5%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、線性范圍寬、靈敏度高、精密度和回收率良好，可為進(jìn)一步研究Hyp的抗氧化作用與機(jī)制奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

高效液相色譜法；人肝細(xì)胞L02；金絲桃苷

金絲桃苷（Hyperoside，Hyp）屬黃酮醇苷化合物，結(jié)構(gòu)為槲皮素-3-半乳糖苷，是臨床上疏肝解郁、清熱解毒藥方中金銀花、菟絲子、貫葉連翹、山楂等的主要黃酮類(lèi)活性成分。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，Hyp對(duì)缺血性腦損傷、心肌損傷、肝損傷與腎損傷均有顯著保護(hù)效應(yīng)，其作用機(jī)制主要為抗氧化[1，2]。Hyp進(jìn)入細(xì)胞并維持一定的濃度，是其發(fā)揮抗氧化作用的首要前提。因此，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp的含量有助于了解其在細(xì)胞內(nèi)的潴留情況，以便為Hyp的抗氧化作用與機(jī)制研究提供充分的證據(jù)。本文以人肝細(xì)胞L02為研究模型，建立以高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定L02細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp含量的方法，為Hyp的抗氧化研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1100 HPLC系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）；CL31R型離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；Q型超純水器（美國(guó)Milli-Qplus公司）；MODEL3111型細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司）；Hyp原料藥（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：ZL0910010A，純度：98%）；Hyp對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1521-200202）；去離子水（筆者自制）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

人肝細(xì)胞L02購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物所細(xì)胞中心。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

L02與以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整密度至2.25×105·mL-1，接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h。加藥處理時(shí)，細(xì)胞用含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。

待細(xì)胞處理結(jié)束后收集培養(yǎng)液，于4℃、12000r·min-1離心10min，小心吸取2mL上清置EP管中，即為細(xì)胞外樣品溶液。以5mL冷的PBS洗滌細(xì)胞2次后，加入5mL新的含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，于－70℃與37℃反復(fù)凍融3次，收集細(xì)胞裂解物于4℃、16000r·min-1離心10min，吸取2mL上清置EP管中，即為細(xì)胞內(nèi)樣品溶液。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取Hyp對(duì)照品適量，以甲醇溶解制成濃度為1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4℃貯藏，備用。

用空白細(xì)胞外樣品溶液稀釋Hyp標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成濃度分別為2、5、10、20、50、100、200μg·mL-1的細(xì)胞外標(biāo)準(zhǔn)溶液。用空白細(xì)胞內(nèi)樣品溶液稀釋Hyp標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10μg·mL-1的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃貯藏，備用

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件[3]色譜柱：KROMASIL C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸（45∶55）；柱溫：30℃；流速：1.0mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；進(jìn)樣體積：30μL。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以“2.2”項(xiàng)下方法制得的標(biāo)準(zhǔn)溶液按1∶1比例加入甲醇，充分混勻后于13000r·min-1離心5min，小心吸取上清，自動(dòng)進(jìn)樣30μL，以Hyp峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，Hyp濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

2.3.3 回收率、精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 用空白細(xì)胞外樣品溶液稀釋Hyp標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成質(zhì)量濃度分別為5、20、100μg·mL-1的細(xì)胞外樣品溶液；用空白細(xì)胞內(nèi)樣品溶液，精密加入Hyp標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配制成濃度分別為0.2、1、5μg·mL-1的細(xì)胞內(nèi)樣品溶液，自動(dòng)進(jìn)樣30μL（每個(gè)濃度進(jìn)樣5針），記錄色譜峰峰面積，按回歸方程計(jì)算回收率。同法制備上述溶液，于日內(nèi)與日間（5d）進(jìn)樣，考察方法精密度。處理后的樣品溶液室溫下避光放置10、22h，未處理的樣品溶液于－20℃放置3、6d后分別測(cè)定Hyp含量，考察樣品穩(wěn)定性。

2.4 細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp的含量測(cè)定

按不同時(shí)間段將L02分為5組，以含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整密度至2.25×105·mL-1，接種于75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24h后，加入Hyp濃度為80μg·mL-1的含5%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。分別于加藥后0、3、6、12、24h按“2.1”項(xiàng)下方法收集得細(xì)胞內(nèi)、外樣品溶液。樣品溶液按1∶1的比例加入甲醇，充分混勻后于13000r·min-1離心5min，小心吸取上清，取30μL 進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，由SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。

3 結(jié)果

3.1 方法專(zhuān)屬性

分別取空白細(xì)胞樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，在本色譜條件下，細(xì)胞內(nèi)、外液中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)Hyp的測(cè)定無(wú)干擾，Hyp的保留時(shí)間分別約為8.11、8.08min。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白細(xì)胞外樣品溶液；B.細(xì)胞外標(biāo)準(zhǔn)溶液；C.細(xì)胞外樣品溶液；D.空白細(xì)胞內(nèi)樣品溶液；E.細(xì)胞內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液；F.細(xì)胞內(nèi)樣品溶液Fig1 Chromatogram of Hyp in L02cellsA.blank extracellular solution；B.extracellular standard solution；C.extracellular sample；D.blank intracellular solution；E.intracellular standard solution；F.intracellular sample

3.2 線性關(guān)系

得細(xì)胞外樣品回歸方程為Y＝35.412X－8.586（r＝0.9999）；細(xì)胞內(nèi)樣品回歸方程為Y＝35.759X－7.422（r＝0.9999）。結(jié)果表明，細(xì)胞外樣品中Hyp檢測(cè)濃度在2～200μg·mL-1范圍內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)樣品中Hyp檢測(cè)濃度在0.1～10μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。細(xì)胞內(nèi)、外液的定量限分別為0.1、2μg·mL-1。

3.3 回收率與精密度試驗(yàn)

按照“2.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定高、中、低濃度回收率，結(jié)果細(xì)胞外液分別為（98.60± 1.52）%、（94.91±1.63）%、（94.50±4.14）%，細(xì)胞內(nèi)液分別為（98.09±2.07）%、（95.52±3.60）%、（97.91±8.20）%。細(xì)胞外、內(nèi)液的日內(nèi)平均RSD分別為1.98%、4.36%，日間平均RSD分別為1.75%、2.86%，表明本分析方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好。回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab1 Results of recovery and precision test（s±s）

表1 回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab1 Results of recovery and precision test（s±s）

樣品類(lèi)型細(xì)胞外液細(xì)胞內(nèi)液c/μg·mL-1 5201000.215相對(duì)回收率/%94.50±4.1494.91±1.6398.60±1.5297.91±8.2095.52±3.6098.09±2.07日內(nèi)RSD/%2.981.491.468.672.292.13日間RSD/%1.042.381.824.513.110.96

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后的樣品，避光貯藏的穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，細(xì)胞外樣品溶液處理后室溫避光放置10、22h，未處理溶液于－20℃放置3、6d的平均RSD分別為0.9%、4.5%、0.5%、0.5%；細(xì)胞內(nèi)樣品溶液分別為0.4%、1.1%、1.0%、1.0%。Hyp在細(xì)胞內(nèi)、外液中的放置穩(wěn)定性見(jiàn)表2。

表2 Hyp在細(xì)胞內(nèi)、外液中的放置穩(wěn)定性（n＝5）Tab2 Stability of Hyp in L02cells（n＝5）

3.5 樣品含量測(cè)定

按照“2.4”項(xiàng)下方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp含量。結(jié)果表明，隨著孵育時(shí)間的增加，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hyp量也逐漸增加。細(xì)胞培養(yǎng)12h，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hyp達(dá)峰值11.88%，隨后細(xì)胞內(nèi)的Hyp含量又緩慢下降。不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp的含量見(jiàn)表3。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp的含量（n＝3）Tab3 Concentration of Hyp in L02cells after exposure to Hyp solution for various time（n＝3）

4 討論

目前，L02被廣泛用作藥物肝保護(hù)效應(yīng)研究的模型[4，5]，但有關(guān)HPLC法測(cè)定L02細(xì)胞內(nèi)、外液中肝保護(hù)藥物的含量卻尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以了解Hyp在L02內(nèi)的潴留過(guò)程為目的，建立了細(xì)胞內(nèi)、外液中Hyp含量測(cè)定的HPLC法，為抗氧化研究中Hyp的給藥濃度與時(shí)間的選擇提供了充分的證據(jù)。

本研究在參考文獻(xiàn)[6]的基礎(chǔ)上，采用反復(fù)凍融的方法制備細(xì)胞內(nèi)樣品溶液。3次凍融結(jié)束后，在顯微鏡下未見(jiàn)形態(tài)完整的細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞破碎成功。該方法既避免了使用化學(xué)試劑破碎細(xì)胞帶來(lái)的試驗(yàn)干擾，也能夠保持檢測(cè)藥物的完整性，且本方法簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好，符合HPLC檢測(cè)要求。

此外，本研究?jī)H采用甲醇沉淀蛋白進(jìn)行樣品前處理，整個(gè)操作過(guò)程較為簡(jiǎn)單。因此，在確保準(zhǔn)確進(jìn)樣、平行操作的前提下，選用簡(jiǎn)便易行的外標(biāo)法進(jìn)行Hyp的定量測(cè)定[7，8]。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，終濃度為80μg·mL-1的Hyp與L02共孵育12h后，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hyp達(dá)到峰值（11.88%），24h后又逐漸降低，這提示在后續(xù)的抗氧化研究中Hyp預(yù)保護(hù)L02的時(shí)間最好設(shè)在12～24h范圍內(nèi)。雖然Hyp的結(jié)構(gòu)中含有糖基，進(jìn)入細(xì)胞的能力較其他脂溶性藥物低，但水溶性的增加也可以減少溶液配制時(shí)DMSO等助溶劑的使用，從而減少對(duì)細(xì)胞的毒性。孵育24h后，細(xì)胞內(nèi)Hyp濃度逐漸降低，提示可能與其轉(zhuǎn)變成其他代謝產(chǎn)物有關(guān)[9，10]。據(jù)報(bào)道，Hyp進(jìn)入細(xì)胞后可以原型或代謝產(chǎn)物形式，通過(guò)螯合金屬離子、直接清除自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)等機(jī)制發(fā)揮對(duì)各種細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)[11，12]。

綜上所述，本文建立的HPLC方法專(zhuān)屬性好，回收率、精密度高，且方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可快捷地分析Hyp在細(xì)胞內(nèi)、外動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律，可為進(jìn)一步探討Hyp的抗氧化效應(yīng)和機(jī)制奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

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Content Determination of Hyperoside in L02Cells by HPLC

XING Hai-yan，XIA Pei-yuan，DAI Qing，CHEN Jian-hong，SUN Feng-jun
（State Base of Drug Research and Clinical Pharmacology，The First Affiliated Hospital of Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC method for the content determination of hyperoside（Hyp）in L02cells.METHODS：HPLC was used to determine the concentrations of Hyp in L02cells，after co-cultured with Hyp at the concentration of 80μg·mL-1for 0，3，6，12，24h.HPLC analysis was performed on a KROMASIL C18（250mm×4.6mm，5μm）column at flow rate of 1.0mL·min-1using methanol-0.4%phosphoric acid（45∶55）as mobile phase with UV detection at 360nm.The column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of extracellular Hyp was 2～200μg·mL-1and that of intracellular Hyp was 0.1～10μg·mL-1（r＝0.9999）.The standard curves of extracellular Hyp wasY＝35.759X－7.422and that of intracellular Hyp wasY＝35.412X－8.586.Average recovery rates of extracellular and intracellular Hyp were（96.00%±2.43%）and（97.18%±4.62%）.The RSD of intra-day and inter-day were 1.75%and 2.86%，respectively.The treated samples were kept at room temperature for 22hours and untreated samples were kept at－20℃ for 6days.The average RSD was below 5%.CONCLUSION：The results show that established HPLC method is simple，accurate and sensitive for the content determination of Hyp in L02cells.The wide liner range，satisfied precision and good mean recovery guarantee it can be used for further study of antioxidative effect of Hyp.

HPLC；L02cells；Hyperoside

R285；R969

A

1001-0408（2011）19-1731-04

Δ國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30572366）

＊博士研究生。研究方向：天然植物藥的藥理學(xué)。電話：023-68765991。E-mail：haiyanxing@yahoo.com.cn

#通訊作者：教授，博士研究生導(dǎo)師，博士。研究方向：新藥藥理研究及評(píng)價(jià)。電話：023-68754438。E-mail：py_xia@yahoo.com.cn

2010-09-10

2010-10-26）