無花果葉補骨脂素對體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞的影響Δ

王濤，陶如，李清華，高永峰，周成軍，劉金成

（1.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)教研室，泰安市 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)部，泰安市 271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，泰安市 271000；4.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥學(xué)綜合實驗室，泰安市 271000；5.山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南市 250033；6.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，青島市 266021）

無花果葉補骨脂素對體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞的影響Δ

王濤1＊，陶如2，李清華3，高永峰4，周成軍5，劉金成6

（1.泰山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生物化學(xué)教研室，泰安市 271000；2.泰山醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)部，泰安市 271000；3.泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，泰安市 271000；4.泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥學(xué)綜合實驗室，泰安市 271000；5.山東大學(xué)第二醫(yī)院，濟南市 250033；6.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，青島市 266021）

目的：研究無花果葉補骨脂素（FLP）對瘢痕疙瘩成纖維細胞的生長抑制作用。方法：用FLP處理體外培養(yǎng)的成纖維細胞后進行細胞形態(tài)學(xué)檢測，通過細胞增殖試驗（MTT法）和流式細胞儀檢測FLP對成纖維細胞增殖和凋亡的影響；氯胺T法檢測FLP對成纖維細胞膠原蛋白合成的抑制作用；Western-bloting檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達。結(jié)果：經(jīng)FLP處理后，成纖維細胞增殖活性降低，凋亡指數(shù)升高（P＜0.01），凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達被抑制，同時膠原蛋白的合成受到抑制。結(jié)論：FLP對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖的抑制和誘導(dǎo)其凋亡作用可能是通過抑制凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的作用來實現(xiàn)的。

無花果葉；補骨脂素；瘢痕疙瘩；成纖維細胞；增殖；凋亡

瘢痕疙瘩是一種以膠原纖維等細胞基質(zhì)過度產(chǎn)生和沉積為特征的皮膚纖維化疾病，在皮膚修復(fù)過程中成纖維細胞持續(xù)活化所產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)（ECM）成分，如纖連蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖，尤其是膠原蛋白的過度堆積，從而導(dǎo)致真皮的持久纖維化[1]。抑制成纖維細胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，以及抑制膠原蛋白的合成，是瘢痕疙瘩治療的重點。無花果屬于桑科無花果屬植物（Ficus caricaL.），是目前研究較多的藥食兼優(yōu)的植物。無花果葉所含的主要成分補骨脂素可通過破壞線粒體、減少細胞的能量供應(yīng)、抑制核酸及蛋白質(zhì)的合成、降低有關(guān)酶的活性等途徑，起到抑制多種腫瘤增殖、抗病毒、抗菌的作用[2～4]。但目前尚未有無花果葉補骨脂素（FLP）抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的報道。本研究利用不同劑量的FLP，通過體外試驗觀察其對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用，以及對其膠原合成的影響，并進一步探討其作用機制，為其治療瘢痕疙瘩提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

3k30 型高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；MDF-1156型超低溫冰箱、CO2細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；Bryte型流式細胞儀、iMark型酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；超純水系統(tǒng)（法國Millipore公司）；CKX31型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 試藥

FLP（由泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院從無花果葉中提取和制備，濃度：5mg·mL-1）；青霉素（批號：091107）、鏈霉素（批號：090412）均由華北制藥集團提供；DMEM培養(yǎng)液（美國Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青生物材料工程公司）；Trizol（美國Gibco Brl公司）；鼠抗人Bcl-2單克隆抗體（美國R&D公司）。

1.3 瘢痕疙瘩成纖維細胞

標(biāo)本取自泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科從瘢痕疙瘩患者手術(shù)切取的瘢痕組織。取材部位：前胸、耳垂等；患者年齡：11～28歲；瘢痕生長時間：1～2年。所有患者均無其他器質(zhì)性疾病，未作過特殊治療及激素治療，均經(jīng)過臨床和病理診斷證實。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

在手術(shù)室無菌條件下將手術(shù)切下的病理性瘢痕及周圍正常組織小心去除表皮及皮下脂肪組織，然后在超凈工作臺上用眼科剪刀將組織剪成大小約0.5～1mm3的小塊，加入少量小牛血清，接種于培養(yǎng)瓶中，在95%空氣、5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，使組織塊牢固貼附于瓶壁。然后加入適量含20%小牛血清、100U·mL-1青霉素、100μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每周2次換液。約3～4周，原代培養(yǎng)細胞生長成細胞單層。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1∶2的比例傳代培養(yǎng)。每隔2天用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液換液1次，待細胞鋪滿瓶底后傳代。試驗選用3～10代細胞。

2.2 MTT法檢測細胞抑制率

纖維細胞用0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞懸液，調(diào)整濃度為5×105·mL-1，接種于96孔板內(nèi)，每孔0.2mL。每個樣本設(shè)4個復(fù)孔。置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，待細胞完全貼壁后更換為含F(xiàn)LP的培養(yǎng)液（FLP溶解于二甲亞砜（DMSO）液中，貯存濃度為5mg·mL-1），終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、1000μmol·L-1，重復(fù)10孔，另設(shè)不加FLP的最高濃度DMSO液（20μg·mL-1）作空白對照組。置培養(yǎng)箱中孵育48h后，每孔加入20μLMTT（5mg·mL-1）繼續(xù)孵育4h，之后每孔加入100μL 20%十二烷基硫酸鈉（SDS）有機溶劑，孵育20h后于490nm波長處用酶標(biāo)儀測吸光度（D）值。按抑制率＝1－試驗組D值/空白對照組D值×100%計算，并用Probit回歸法[5]估算半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

2.3 凋亡細胞形態(tài)變化

取對數(shù)生長期的成纖維細胞接種于2.5cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，用10μmol·L-1FLP處理細胞，空白對照組不處理；于加FLP 12、24、48h后，倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)和凋亡情況并照相。

2.4 流式細胞儀觀察細胞凋亡

將處于對數(shù)生長期的成纖維細胞接種于25cm2細胞瓶中，待培養(yǎng)24h細胞貼壁后，用10μmol·L-1FLP處理細胞，分別于12、24、48、72h 后終止培養(yǎng)，制成單細胞懸液濃度為 1×106·mL-1，再以1000r·min-1離心5min，PBS洗滌3次，加入70%冷乙醇2mL固定，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.5 Western-blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達

將處于對數(shù)生長期的成纖維細胞接種于25cm2細胞瓶中，待細胞貼壁后設(shè)空白對照組與試驗組，分別進行處理，轉(zhuǎn)染24h后收集細胞，用PBS洗滌3次，加1×SDS加樣緩沖液（50mmol·L-1Tris（pH 6.8）、1000mmol·L-1DTT、2%SDS、0.1%溴酚藍、10%甘油）裂解細胞2min，收集上述裂解液，并置100℃沸水中水浴5min，以測定蛋白濃度。進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）[5]，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，先封閉，再加入鼠抗人Bcl-2抗體（1∶200）過夜，PBS洗滌3次；加入生物素標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶1000），室溫振蕩1h，PBS洗滌4次，每次10min；加入卵白素-生物素化辣根過氧化物酶，孵育15min；PBS洗滌3次，DAB顯色，約5～10min。

2.6 瘢痕疙瘩成纖維細胞膠原測定（氯胺T法）

配制標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸（Hyp）應(yīng)用液、檸檬酸緩沖液、0.05mol·L-1氯胺 T 溶液、3.15mol·L-1過氯酸溶液、10%對二甲氨基苯甲醛溶液。消化單層培養(yǎng)細胞，以2×105·mL-1接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后設(shè)空白對照組與試驗組。空白對照組換液，試驗組則棄去原培養(yǎng)液，用10μmol·L-1FLP處理細胞，觀察12、24、48、72h。每個時間段分別收集細胞，經(jīng)處理后上機檢測。以Hyp的濃度為測量對象，間接推算膠原含量。取上清液0.5mL，經(jīng)一系列反應(yīng)后在紫外分光光度計下560nm波長處比色測量。計算公式如下：樣品Hyp濃度（μg·mL-1）＝所測Hyp液濃度×稀釋倍數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)Hyp液濃度。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

所有試驗數(shù)據(jù)以±s表示。細胞增殖試驗資料用方差分析處理，其他試驗數(shù)據(jù)用卡方檢驗、Probit回歸法處理。P＜0.05認為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 MTT法檢測細胞抑制情況

將試驗用成纖維細胞以1.0×105·mL-1密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100pL，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至細胞貼壁，加入FLP，使其終濃度為分別為0.01、0.1、1、10、100、1000μmol·L-1，重復(fù)10孔。分別于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入MTT（3mg·mL-1）20pL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄培養(yǎng)基，加入MTT裂解液100pL，37℃、5%CO2孵箱中孵育18h。待紫色結(jié)晶完全溶解后（約20h），于490nm波長處用酶標(biāo)儀測D值，計算抑制率和IC50。經(jīng)5次以上試驗觀察不同時段的FLP對瘢痕組織成纖維細胞增殖是否有抑制或促進作用。結(jié)果表明，10、100、1000μmol·L-1FLP能抑制瘢痕組織成纖維細胞的增殖，其D值與空白對照組比較，均有顯著性差異（P＜0.01）。FLP對瘢痕組織成纖維細胞抑制的影響見表1。

表1 FLP對瘢痕組織成纖維細胞抑制的影響（±s，n＝5）Tab1 Inhibition of FLPon keloid fibroblast（s±s，n＝5）

表1 FLP對瘢痕組織成纖維細胞抑制的影響（±s，n＝5）Tab1 Inhibition of FLPon keloid fibroblast（s±s，n＝5）

與0濃度比較：＊P＜0.01vs.zero concentration：＊P＜0.01

c/μmol·L-1-0.010.11101001000D值1.601±0.1521.571±0.0231.538±0.0601.491±0.0131.433±0.123＊0.841±0.064＊0.156±0.011＊抑制率/%02.04.07.010.646.589.8

3.2 成纖維細胞形態(tài)學(xué)變化

取10μmol·L-1FLP1mL，置細胞培養(yǎng)瓶中，于24、48、72h通過倒置相差顯微鏡觀察成纖維細胞形態(tài)變化并與空白對照組比較。結(jié)果，試驗組成纖維細胞數(shù)目減少，體積變小，胞漿量減少，排列紊亂，與鄰近細胞接觸減少，突起變短變少，細胞明顯皺縮，少見細胞分裂。空白對照組細胞形態(tài)正常，胞體呈梭形，細胞核大小及染色均勻，胞漿豐富，細胞間有突起相連，折光性強。FLP處理后成纖維細胞形態(tài)變化見圖1。

圖1 FLP處理后成纖維細胞形態(tài)變化A.空白對照；B.FLP 10μmol·L-124h；C.FLP 10μmol·L-148h；D.FLP 10μmol·L-112hFig1 Morphology of keloid fibroblasts treated with FLPA.blank control；B.FLP 10μmol·L-124h；C.FLP 10μmol·L-148h；D.FLP 10μmol·L-112h

3.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

流式細胞儀檢測顯示，F(xiàn)LP作用12、24、48、72h和空白對照的抑制率分別為（5.88%±1.54%）、（7.04%±1.80%）、（8.21%±1.47%）、（10.84%±3.90%）、（3.02%±1.22%）。FLP對成纖維細胞有明顯抑制作用，隨作用時間的增加成纖維細胞出現(xiàn)亞二倍體小峰，提示FLP可促進細胞凋亡（P＜0.05）。FLP對成纖維細胞凋亡的影響見圖2。

圖2 FLP對成纖維細胞凋亡的影響A.12h；B.24h；C.48h；D.72h；E.空白對照Fig2 Effect of FLPon the apoptosis of fibroblastsA.12h；B.24h；C.48h；D.72h；E.blank control

3.4 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達的變化

Western-blotting檢測結(jié)果表明，培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞有一定量的Bcl-2蛋白表達。加入FLP后各組Bcl-2蛋白表達均有減少，其中1mg·L-1、24h組，1mg·L-1、48h 組與空白對照相比較具有顯著性差異（P＜0.05）。FLP作用后成纖維細胞Bcl-2蛋白的表達見圖3。

3.5 膠原蛋白含量的測定

圖3 FLP作用后成纖維細胞Bcl-2蛋白的表達1.空白對照；2.FLP 10μmol·L-124h ；3.FLP 10μmol·L-148hFig3 Bcl-2protein expression of fibroblasts treated withFLP1.blank control；2.FLP 10μmol·L-124h ；3.FLP 10μmol·L-148h

各試驗組中，Hyp含量無明顯變化；而空白對照組中，不同時間段的Hyp含量隨時間的延長而增加（P＜0.05）。結(jié)果表明，F(xiàn)LP能降低瘢痕成纖維細胞中Hyp的含量。FLP對成纖維細胞膠原蛋白合成的影響見圖4。

圖4 FLP對成纖維細胞膠原蛋白合成的影響A.空白對照；B.FLP 10μmol·L-1Fig4 Effect of FLP on the synthesis of fibroblasts collagen proteinA.blank control；B.FLP 10μmol·L-1

4 討論

瘢痕疙瘩是皮膚的一種良性腫瘤，其臨床表現(xiàn)為瘢痕的過度增生并向正常組織浸潤生長，手術(shù)切除后極易復(fù)發(fā)，當(dāng)今尚無可靠的特異性治療方法[6]。FLP具有抑制腫瘤增殖、促進腫瘤凋亡的作用[7]，這為筆者研究其對增生性瘢痕組織的作用提供了理論依據(jù)。本研究應(yīng)用不同濃度FLP干預(yù)體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞，結(jié)果觀察到FLP對瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖具有明顯抑制作用；進一步試驗觀察到FLP能明顯誘導(dǎo)病理性瘢痕組織成纖維細胞凋亡，同時可抑制膠原蛋白的合成，從而抑制組織的纖維化。瘢痕形成過程中，Bcl-2基因表達異常增加可使已有基因異常改變的成纖維細胞逃避凋亡，由此引起的基因異常事件的積累是導(dǎo)致瘢痕形成的必要前提。增生性瘢痕是組織損傷后修復(fù)過度的一種改變，表現(xiàn)為成纖維細胞的大量增生以及膠原等間質(zhì)蛋白的沉積。Ladin DA等[8]發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩和培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細胞中Bcl-2蛋白表達升高，并伴有細胞凋亡率降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LP可能通過抑制Bcl-2阻斷此信號傳遞途徑而發(fā)揮其抑制細胞增殖、誘導(dǎo)成纖維細胞凋亡的作用，這為防治組織纖維化提供了一條新的研究思路。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)LP具有抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡、抑制膠原蛋白增殖的作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，其機制可能通過抑制Bcl-2表達來發(fā)揮作用。

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Influence of Psoralen of Fig Leaf on Human Keloid Fibroblasts in Vitro

WANG Tao
（Dept.of Biochemistry，Basic Medical College，Taishan Medical University，Taian 271000，China）
TAO Ru
（Medical College，Taishan Medical University，Taian 271000，China）
LI Qing-hua
（The Affiliated Hospital of Taishan Medical University，Taian 271000，China）
GAO Yong-feng
（General Lab of Pharmacy，College of Pharmacy，Taishan Medical University，Taian 271000，China）
ZHOU Cheng-jun
（The Second Hospital of Shandong University，Jinan 250033，China）
LIU Jin-cheng
（Dept.of Biology，Medical College of Qingdao University，Qingdao 266021，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of psoralen of fig leaf（FLP）on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts.METHODS：Human keloid fibroblasts were treated with FLP.Morphology，MTT method and flow cytometry（FCM）were adopted to detect the effect of FLP on the proliferation and apoptosis of human keloid fibroblasts.The inhibition effect of PSO on the synthesis of fibroblasts collagen was determined by chloramines T assay.The protein levels of Bcl-2were detected by Western bloting.RESULTS：After FLP treatment，the proliferation activity of human keloid fibroblasts decreased while the apoptotic index increased（P＜0.01）.Related-apoptosis Bcl-2protein level was inhibited as well as the synthesis of college protein.CONCLUSION：FLP inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human keloid fibrolasts by means of inhibiting related-apoptosis Bcl-2.

Fig leaf；Psoralen；Human keloid；Fibroblasts；Proliferation；Apoptosis

R285；R97

A

1001-0408（2011）19-1746-04

Δ山東省中醫(yī)藥管理局資助項目（2007167）；泰山醫(yī)學(xué)院青年基金資助項目（997）

＊講師，碩士。研究方向：腫瘤分子生物學(xué)。電話：0538-6222050。E-mail：wangtaofch@yahoo.com.cn

2010-09-12

2010-12-19）