星點設計-效應面法優化熊果苷乳膏配方

劉圣，蘇丹，唐麗琴，陳象青，張善堂，方衛

（1.安徽醫科大學附屬省立醫院，合肥市 230001；2.國家中醫藥管理局中藥制劑實驗室，合肥市 230001；3.皖南醫學院，蕪湖市 241002）

星點設計-效應面法優化熊果苷乳膏配方

劉圣1，2＊，蘇丹1，2，唐麗琴1，2，陳象青1，2，張善堂1，2，方衛3

（1.安徽醫科大學附屬省立醫院，合肥市 230001；2.國家中醫藥管理局中藥制劑實驗室，合肥市 230001；3.皖南醫學院，蕪湖市 241002）

目的：優化熊果苷乳膏配方，并建立制劑質量控制方法。方法：采用星點設計-效應面法，以乳膏伸展性為指標，優化十六醇、十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺（2∶1）和二甲基硅油用量；考察配方優化后制劑的外觀性狀、粒度、pH、伸展性、穩定性和熊果苷含量。結果：優化的配方是十六醇用量為60g，十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺（2∶1）用量為10g，二甲基硅油用量為25g；乳膏伸展性較好，延展直徑約58.7mm，符合半流體乳膏特性；pH為6.2；穩定性較好；熊果苷含量為標示量的94.5%。結論：星點設計-效應面法優化的熊果苷乳膏配方穩定、可行。

熊果苷乳膏；星點設計-效應面法；配方優化；高效液相色譜法；質量控制

黃褐斑是一種臨床常見的色素沉著性皮膚病，美白劑和光防護劑是黃褐斑的主要治療手段[1，2]。氫醌（1，4-對苯二酚）等傳統美白劑對皮膚具有脫色素作用，外用表現刺激反應，引起皮膚紅斑、脫屑、瘙癢、刺痛、過敏，甚至引起永久性損害，臨床應用受到限制，并在歐洲被禁用。熊果苷（4-羥基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷）及其衍生物結構類似氫醌，但細胞毒性較小，相對比較安全；其體外、體內均能有效地抑制黑素細胞酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的形成，并可通過自身與酪氨酸酶直接結合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積[3～5]。熊果苷作為美白劑已在化妝品中廣泛應用，臨床也用于黃褐斑的治療[6，7]。本試驗將熊果苷制備成乳膏劑，采用集數學和統計學于一體的星點設計-效應面法進行配方優化試驗，以乳膏伸展性為指標，優化配方十六醇、十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺和二甲基硅油用量；考察配方優化后制劑的外觀、性狀、pH、伸展性和穩定性，并建立熊果苷高效液相色譜（HPLC）含量測定方法。

1 儀器與試藥

JJ-1精密增力電動攪拌器（上海圣科儀器設備有限公司）；Universal 32R臺式冷凍離心機（德國Hettich公司）；WD-A藥物穩定性檢查儀（天津藥典標準儀器廠）；DA-1000電子天平（莆田市亞太計量儀器有限公司）；HP8453紫外-可見分光光度計（美國惠普公司）；LC-6AHPLC儀（日本島津公司）。

α-熊果苷（鄭州荔諾生物科技有限公司，批號：XGG 20090416-001，含量：99.08%）；十六醇（國藥集團化學試劑有限公司，批號：T20080527）；十二烷基硫酸鈉（廣東汕頭西隆化工廠，批號：070109-1）；硬脂酸（湖南爾康制藥有限公司，批號：20090802）；三乙醇胺（上海振企化學試劑有限公司，批號：20080110）；白凡士林（南昌白云藥業有限公司，批號：F20050006）；甘油（南昌白云藥業有限公司，批號：20090402）；羥苯乙酯（臺山市新寧制藥有限公司，批號：20070703）；亞硫酸氫鈉（湖南爾康制藥有限公司，批號：20060702）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA，天津市長鑫宏翔商貿有限公司，批號：20090317）；二甲基硅油（安徽威爾曼制藥有限公司，批號：070901）；甲醇、乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 乳化劑選擇

在預試驗的基礎上，初步以熊果苷30g、十六醇80g、白凡士林20g、甘油50g、二甲基硅油20g、亞硫酸氫鈉3g、EDTA 1g、羥苯乙酯1g為固定處方，純化水適量，處方總量1000g。單獨選擇十二烷基硫酸鈉10g為乳化劑，制得的乳膏為白色，質地粗糙，pH值在5.0以下；單獨選擇三乙醇胺8g和硬脂酸56g為乳化劑，制備的乳膏為白色，質地均勻、細膩，pH值在7.0以上；選擇十二烷基硫酸鈉4g、三乙醇胺4g和硬脂酸28g組成復合乳化劑，制備的乳膏為白色，質地均勻、細膩，pH值在5.0～7.0之間。故選擇十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺和硬脂酸為復合乳化劑。選擇三乙醇胺與硬脂酸比例為1∶7，分別以十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺1∶1、1.5∶1、2∶1組成復合乳化劑，用量10g。結果，比例為2∶1時，制備的乳膏pH值在6.0左右。因此，試驗以三乙醇胺-硬脂酸（1∶7）為固定比例，優化十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺（2∶1）配方用量。

2.2 乳膏制備

取十六醇、硬脂酸、白凡士林、二甲基硅油加熱熔化，保持溫度70℃，此為油相；另取純化水煮沸驅氧放至75℃時，依次加入十二烷基硫酸鈉、三乙醇胺、甘油、羥苯乙酯、亞硫酸氫鈉、EDTA和熊果苷，使溶解為水相。將水相緩緩加入油相中，以轉速200～300r?min-1不斷攪拌15～30min，使之充分乳化至冷凝，即得。

2.3 乳膏延展性測定[8]

取2塊平行的10×20cm2大小的玻璃板，上面一塊重125g（加砝碼補足重量）。室溫[（25±3）℃]放置24h后稱取各試驗點乳膏1g，置于兩玻璃板之間，1min后測定延展直徑，取最大與最小平均值。

2.4 配方優化

2.4.1 優化設計 選取十六醇用量（X1）、十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺（2∶1）用量（X2）與二甲基硅油用量（X3）為考察因素，每個因素設5個水平，分別用代碼 -r、-1、0、+1、+r表示，r＝1.682，考察3個因素對乳膏伸展性（Y）的影響。因素水平見表1；試驗安排與結果見表2。

2.4.2 模型擬合與預測 按各試驗點配方制備乳膏。以Y為因變量，X1、X2、X3為變量，用Excel對上述試驗結果進行二次多項式非線性回歸，得三元二次回歸方程為Y＝127.15－1.11X1－1.65X2－1.35X3+0.0088X1X2+0.017X1X3+0.0058X2X3+0.0017X12+0.051X22+0.012X32。復相關系數（r）＝0.9881，P＜0.001。回歸分析中，X1、X2與X3的偏回歸系數對應的P值分別為0.02、0.7與0.08，所以X1對Y有顯著性影響，X3對Y有影響但不顯著，X2對Y的影響較小。對回歸方程規劃求解，求出因變量最大預測值Y＝63.4mm，變量X1＝60g、X2＝8g、X3＝30g。

表1 因素水平Tab1 Factors and levels

表2 試驗安排與結果Tab2 Experiment arrangements and results

2.4.3 效應面圖繪制與預測 由于效應面圖只能表達含2個自變量的函數，故固定3個自變量之一為中值，代入回歸方程作為目標函數，應用Origin7.5軟件繪制三維效應面圖和二維等高線圖。由圖可知，在一定范圍內，隨著X1減少和X3增大，Y增大，X2對Y無明顯影響。預測最佳范圍X1＝60～65g，X2＝8～10g，X3＝25～30g，與用Excel對回歸方程規劃求解的結果基本一致。本試驗設計熊果苷乳膏為半流體乳膏，延展直徑控制在60mm左右，結合預測結果，確定熊果苷乳膏最優配方為：熊果苷30g、十六醇60g、十二烷基硫酸鈉6.7g、三乙醇胺3.3g、硬脂酸23g，白凡士林20g、甘油50g、二甲基硅油25g、亞硫酸氫鈉3g、EDTA 1g、羥苯乙酯1g，純化水適量，處方總量1000g。三維效應面圖見圖1；二維等高線圖見圖2。

2.5 工藝驗證

根據優選出的熊果苷乳膏配方制備3批乳膏，測得的延展性為實測值；選擇X1＝60g、X2＝10g、X3＝25g代入擬合的回歸方程，求得的延展性為預測值，按下式計算偏差：偏差（%）＝（預測值－實測值）/預測值×100%。結果，偏差為4.1%，表明預測值與實測值相近。

圖1 三維效應面圖A.十六醇用量與二甲基硅油用量對伸展性的影響；B.十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺用量與二甲基硅油用量對伸展性的影響；C.十六醇用量與十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺用量對伸展性的影響Fig 1Three-dimensional response surfaceA.effect of amount of cetyl alcohol and dimethicone on the spreadability of cream；B.effect of amount of sodium lauryl sulfate-triethanolamine and dimethicone on the spreadability of cream；C.effect of amount of cetyl alcohol and sodium lauryl sulfate-triethanolamine on the spreadability of cream

2.6 乳膏質量

2.6.1 性狀 本品為白色，質地均勻、細膩的半流體狀乳膏。

2.6.2 粒度 取乳膏適量，置于載玻片上，涂成薄層，覆以蓋玻片，共涂3片，照2005年版《中國藥典》（一部）第一法（顯微鏡法）[8]測定，粒子直徑在5～50μm之間，符合規定。

2.6.3 穩定性[9]（1）離心試驗：取乳膏10g裝入帶刻度的離心管中，于轉速3000r?min-1的離心機離心30min，乳膏均無油水分層現象。（2）耐熱試驗：取乳膏50g分裝入密閉容器內，在55℃的恒溫箱中保持6h，乳膏膏體基本無變化，無油水分離現象。（3）耐寒試驗：取乳膏50g分裝入密閉容器內，分別于5℃冷藏室和－15℃冷凍箱保持24h后取出，待恢復至室溫后乳膏膏體未變粗糙，無油水分離現象。

圖2 二維等高線圖A.十六醇用量與二甲基硅油用量對伸展性的影響；B.十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺用量與二甲基硅油用量對伸展性的影響；C.十六醇用量與十二烷基硫酸鈉-三乙醇胺用量對伸展性的影響Fig2 Two-dimensional contour mapA.effect of amount of cetyl alcohol and dimethicone on the spreadability of cream；B.effect of amount of sodium lauryl sulfate-triethanolamine and dimethicone on the spreadability of cream；C.effect of amount of cetyl alcohol and sodium lauryl sulfate-triethanolamine on the spreadability of cream

2.6.4 pH值 取本品5g，加水25mL稀釋攪拌均勻后測定[10]，得乳膏pH 6.2，RSD＝2.5%（n＝3）。

2.6.5 延展性 按“2.3”項下方法測定，乳膏延展直徑為58.7mm，RSD＝0.97%（n＝3）。

2.6.6 含量測定采用HPLC法。色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）-甲醇-冰乙酸（89∶10∶1）；流速∶0.8mL·min-1；進樣量：20μL；檢測波長：283nm；柱溫：25℃。在此條件下，供試品中熊果苷色譜峰的保留時間與對照品一致，約為5.2min，空白樣品無干擾。得回歸方程為A＝5508.9c+1943.8（r＝0.9999），測得本品含熊果苷（C12H16O7）為標示量的94.5%。色譜見圖3。

3 討論

圖3 高效液相色譜圖A.對照品；B.樣品；C.空白樣品；1.熊果苷Fig3 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.blank sample；1.arbutin

國內處方設計優化多采用正交設計、均勻設計等方法，但優選的方案只能限制在已定的水平之上，不宜采用線性和非線性方程擬合試驗結果與影響因素之間的關系，很難得出一定范圍內的最優方案[11]。星點設計-效應面法是集數學和統計學于一體的優化方法，既可以進行線性擬合，也可以進行非線性擬合，但通常在最佳條件附近，指標與影響因素之間的關系為非線性，此時選用二次多項式或更高層次的多項式進行擬合，以得到最佳的模型擬合度，能形象、直觀地解決配方優化問題。在本試驗設計范圍，乳膏延展直徑與乳化劑用量無明顯關系，故未進行線性擬合，直接采用二次多項式非線性模型擬合與預測。效應面圖和等高線圖可較好地描述因素與指標的關系，但在試驗區域內沒有唯一穩定點，這可能是熊果苷乳膏延展性與十六醇和二甲基硅油用量呈近似線性關系、與乳化劑用量無明顯相關性有關。根據二次回歸方程、三維效應面圖和二維等高線圖預測值，制備的熊果苷乳膏符合半流體乳膏設計要求，且質量穩定。因此，星點設計-效應面法可用于乳膏配方優化。

采用正相法將油相加入水相與反相法將水相加入油相制備乳膏進行比較可知，反相法制備的乳膏細膩、有光澤，因此本品采用反相法制備熊果苷乳膏。

2005年版《中國藥典》（一部）將乳膏劑分在軟膏劑項下，延展直徑≤50mm的軟膏稱為半鋼體（semi-stiff）軟膏，延展直徑在50～70mm范圍內的軟膏稱為半流體（semi-fluid）軟膏[9]。試驗考察熊果苷乳膏延展性范圍在40～70mm之間，半流體乳膏涂展性較好，且質量穩定，因此將其設計為半流體乳膏，延展直徑控制在60mm左右。

熊果苷為酚苷，在弱酸性條件下很容易水解為葡萄糖和氫醌[12]。氫醌性質不穩定，暴露空氣、遇光極易氧化成醌類，在堿性溶液中更不穩定[13]。為了提高制劑穩定性，本試驗設計熊果苷乳膏的pH值在5.0～7.0之間。

熊果苷作為美白劑在化妝品和醫藥學研究方面已經受到關注，但其含量分析文獻報道較少。由于國內目前尚無熊果苷對照品，本試驗選用含量為99.08%的熊果苷原料作為對照品進行制劑含量測定，取得了較理想的效果。試驗曾選用甲醇-水、乙腈-水為流動相，熊果苷出峰時間過早，且形成拖尾現象。參照文獻方法[14]，選用磷酸鹽緩沖液（pH 5.0）-甲醇-冰乙酸（89∶10∶1）為流動相，熊果苷能以穩定的分子形式存在，保留時間約5.2min，無拖尾現象。在此條件下，氫醌保留時間約7.0min，可用作制劑的穩定性考察。

[1] Solano F，Briganti S，Picardo M，et al.Hypopigmenting agents：an updated review on biological，chemical and clinical aspects[J].Pigment Cell Res，2006，19（6）：550.

[2] Lakhdar H，zouhair K，Khadir K，et al.Evaluation of the effectiveness of a broadspectrum sunscreen in the prevention of chloasma in pregnant women[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2007，21（6）：738.

[3] Hu ZM，Zhou Q，Lei TC，et al.Effects of hydroquinone and its glucoside derivatives on melanogenesis and antioxidation：Biosafety as skin whitening agents[J].J Dermatol Sci，2009，55（3）：179.

[4] Lim YJ，Lee EH，Kang TH，et al.Inhibitory effects of arbutin on melanin biosynthesis of alpha-melanocyte stimulating hormone-induced hyperpigmentation in cultured brownish guinea pig skin tissues[J].Arch Pharm Res，2009，32（3）：367.

[5] Chawla S，deLong MA，Visscher MO，et al.Mechanism of tyrosinase inhibition by deoxy arbutin and its secondgeneration derivatives[J].Br J Dermatol，2008，159（6）：1267.

[6] Baumann L，Woolery-Lloyd H，Friedman A.“Natural”ingredients in cosmetic dermatology[J].J Drugs Dermatol，2009，8（Suppl 6）：5.

[7] Ertam I，Mutlu B，Unal I，et al.Efficiency of ellagic acid and arbutin in melasma：a randomized，prospective，open-label study[J].J Dermatol，2008，35（9）：570.

[8] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：附錄12、附錄60.

[9] 屠錫德，張鈞壽，朱家璧.藥劑學[M].北京：人民衛生出版社，2002：847.

[10] 陸林杰，王 雪.復方賽庚啶乳膏的制備及質量控制[J].中國藥房，2008，19（10）：774.

[11] 李云雁，胡傳榮.試驗設計與數據處理[M].北京：化學工業出版社，2008：171.

[12] Jahodár L，Leifertová I，Lisá M.Elimination of arbutin from the organism[J].Pharmazie，1983，38（11）：780.

[13] 安徽省衛生廳.安徽省醫院制劑規范[S].合肥：安徽科學技術出版社，1999：158.

[14] Thongchai W，Liawruangrath B，Liawruangrath S.Highperformance liquid chromatographic determination of arbutin in skin-whitening creams and medicinal plant extracts[J].J Cosmet Sci，2007，58（1）：35.

Optimization of the Formula of Arbutin Cream by Central Composite Design-response Surface Methodology

LIU Sheng，SU Dan，TANG Li-qin，CHEN Xiang-qing，ZHANG Shan-tang
（The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001，China）
LIU Sheng，SU Dan，TANG Li-qin，CHEN Xiang-qing，ZHANG Shan-tang
（Laboratory of Chinese Materia Medica Preparation of SATCM，Hefei 230001，China）
FANG Wei
（Wannan Medical College，Wuhu 241002，China）

OBJECTIVE：To optimize the formula of Arbutin cream，and to establish its quality control method.METHODS：Using central composite design-response surface methodology，the formula of Arbutin cream was optimized using the spreadability of cream as index and with the amounts of cetyl alcohol，sodium lauryl sulfate-triethanolamine（2∶1）and dimethicone as independent variables.The appearance characteristic，article size，pH value，spreadability，stability of preparation and the content of arbutin were studied.RESULTS：The optimal conditions were cetyl alcohol 60g，sodium lauryl sulfate-triethanolamine（2∶1）10g，and dimethicone 25g.According to the optimal conditions，the diameter of spreadability of prepared cream was about 58.7mm，and cream suited with the property of semi-fluid cream.The pH value of cream ranged was 6.2.The content of arbutin was 94.5%of labeling amount.CONCLUSION：Central composite design-response surface methodology is stable and feasible.

Arbutin cream；Central composite design-response surface methodology；Formula optimization；HPLC；Quality control

R283；R284

A

1001-0408（2011）19-1771-04

＊副主任藥師，碩士研究生導師。研究方向：中藥微丸制劑和質量。電話：0551-2283378。E-mail：lslcclhl@163.com

2010-04-01

2010-06-27）