HPLC法同時(shí)測(cè)定杠板歸中阿魏酸與香草酸的含量Δ

黃家宇，李莉，劉青，盛鈺，羅天軍，劉豫

（1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng)市 550004；2.貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司，貴陽(yáng)市 550018）

HPLC法同時(shí)測(cè)定杠板歸中阿魏酸與香草酸的含量Δ

黃家宇1＊，李莉1#，劉青1，盛鈺1，羅天軍2，劉豫1

（1.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽(yáng)市 550004；2.貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司，貴陽(yáng)市 550018）

目的：建立同時(shí)測(cè)定杠板歸中阿魏酸與香草酸含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為1.0%甲酸-甲醇（40∶60），流速為1.0mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為290nm。結(jié)果：阿魏酸進(jìn)樣量的線性范圍為 0.6～3.0μg（r＝0.9995），平均回收率為99.32%，RSD＝1.06%（n＝9）；香草酸進(jìn)樣量的線性范圍為0.454～2.270μg（r＝0.9999），平均回收率為99.92%，RSD＝2.17%（n＝9）。結(jié)論：本方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于杠板歸藥材的質(zhì)量控制。

杠板歸；阿魏酸；香草酸；高效液相色譜法；含量測(cè)定

杠板歸又名貫葉蓼、蛇牙草等，為蓼科蓼屬植物杠板歸Polygonum perfoliatumL.的干燥全草[1]，為貴州省少數(shù)民族用藥，具有清熱解毒、利濕消腫、散瘀止血之功效。其所含的有機(jī)酸類（阿魏酸、咖啡酸、香草酸等）已被證實(shí)具有多種藥理作用。近年來(lái)，杠板歸被廣泛應(yīng)用于中藥制劑中，如抗婦炎膠囊、康婦靈膠囊、杠板歸糖漿等。為了更好地控制杠板歸藥材的質(zhì)量，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[2～4]建立了以高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定杠板歸中阿魏酸和香草酸含量的方法，獲得了滿意的結(jié)果，可為進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)杠板歸這一藥用資源提供參考。

1 儀器與試藥

1100 型HPLC儀系統(tǒng)，包括二極管陣列檢測(cè)器、色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；SG8200H超聲清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；AUY220電子天平（日本島津公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（上海科析儀器試驗(yàn)廠）；DHG-9420A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

香草酸（批號(hào)：110776-200402，供含量測(cè)定用）、阿魏酸（批號(hào)：110773-200611，供含量測(cè)定用）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；杠板歸（貴州遠(yuǎn)程制藥有限責(zé)任公司提供，產(chǎn)自貴州不同地區(qū)，均由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德講師鑒定為真品）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：1.0%甲酸-甲醇（40∶60）；流速：1.0mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；進(jìn)樣量：10μL。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取阿魏酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲酸-甲醇（5∶95）溶液制成每1mL含0.60mg的溶液，即得阿魏酸對(duì)照品溶液。取香草酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲酸-甲醇（5∶95）溶液制成每1mL含0.908mg的溶液，即得香草酸對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液[2]取杠板歸適量，粉碎，過(guò)3號(hào)篩，稱取2g，精密稱定，置100mL具塞錐形瓶中，加甲醇50mL，放置3h，超聲處理（功率：500W，頻率：59kHz）1h，搖勻，濾過(guò)，殘?jiān)眉状?0mL洗滌3次，合并濾液并蒸干，用0.5moL·L-1氫氧化鈉溶液30mL分3次溶解，轉(zhuǎn)入錐形瓶中，50～60℃水浴回流2h，放冷，移入分液漏斗中，用5mL水洗滌錐形瓶，洗滌液并入分液漏斗中，用鹽酸調(diào)pH值為2，用乙醚萃取4次，每次20mL，合并乙醚液，于50～60℃水浴蒸干，用甲酸-甲醇（5∶95）溶液溶解并定容至10mL，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，取濾液作為阿魏酸和香草酸測(cè)定用供試品溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密量取阿魏酸對(duì)照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置10mL量瓶中，加甲酸-甲醇（5∶95）溶液稀釋至刻度，得線性系列溶液，按上述色譜條件測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，阿魏酸進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y＝3970.386X－26.395（r＝0.9995）。結(jié)果表明，阿魏酸進(jìn)樣量在0.6～3.0μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

精密量取香草酸對(duì)照品溶液適量，用甲酸-甲醇（5∶95）溶液稀釋至0.454mg·mL-1。精密量取此溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置10mL量瓶中，用甲酸-甲醇（5∶95）溶液稀釋至刻度，按上述色譜條件測(cè)定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，香草酸進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為Y＝1866.112X+15.2810（r＝0.9999）。結(jié)果表明，香草酸進(jìn)樣量在0.454～2.270μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

分別取阿魏酸對(duì)照品溶液和香草酸對(duì)照品溶液各10μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積。結(jié)果，二者RSD分別為0.93%和1.02%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（遵義市朝陽(yáng)村）10μL，分別于0、2、4、6、8、12h各測(cè)定一次峰面積。結(jié)果，阿魏酸與香草酸峰面積的RSD分別為1.10%和0.93%（n＝6），表明供試品溶液至少在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)杠板歸樣品（臺(tái)江縣），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果，阿魏酸和香草酸含量的RSD分別為2.2%和1.7%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取6份已知含量（阿魏酸：2.420mg·g-1、香草酸：1.01mg·g-1）的樣品1.0g，精密稱定，分別精密加入阿魏酸對(duì)照品和香草酸對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按樣品含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 樣品含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法測(cè)定樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)[2，3]報(bào)道，阿魏酸和香草酸的最大吸收波長(zhǎng)分別為324nm和290nm。經(jīng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)選擇290nm為測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，可同時(shí)兼顧測(cè)定兩者含量。而且，預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明樣品中香草酸含量較低，選擇其最大吸收波長(zhǎng)為含量測(cè)定波長(zhǎng)，可提高香草酸的靈敏度。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab1 Results of recovery tests（n＝9）

表2 貴州不同產(chǎn)地樣品中阿魏酸與香草酸含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab2 Results of content determination of ferulic acid and vanillic acid in samples from different habitats of Guizhou province（n＝3）

試驗(yàn)考察了超聲提取法與水浴回流提取法，結(jié)果表明超聲1h與水浴回流2h測(cè)得的阿魏酸、香草酸含量差別不大，故采用超聲提取法提取樣品。考察超聲提取時(shí)間時(shí)，選用了60、90、120min進(jìn)行超聲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲120min比超聲60min的目標(biāo)成分增加量并不明顯，故確定超聲時(shí)間為60min。

阿魏酸不穩(wěn)定，遇光和熱容易分解[4]，故應(yīng)將對(duì)照品和供試品加入一定量的酸且在避光及冷藏（4℃）條件下貯藏，以提高其穩(wěn)定性。水浴回流時(shí)考慮到阿魏酸不耐熱，溫度選擇50～60℃。

綜上，本方法靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于杠板歸的質(zhì)量控制。

[1] 全國(guó)中草藥匯編編寫組.全國(guó)中草藥匯編（上冊(cè)）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：416.

[2] 黃勁梅，鄭清瑗，梁惠珍.胡黃連中香草酸、阿魏酸和肉桂酸的含量測(cè)定[J].中藥材，2002，25（12）：88.

[3] 李 康，陳曉輝，畢開(kāi)順.RP-HPLC法測(cè)定地骨皮中香草酸的含量[J].中草藥，2005，36（2）：446.

[4] 李艷秋.用HPLC法測(cè)定四川省不同產(chǎn)地的川芎中阿魏酸的含量[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2009，9（2）：153.

Content Determination of Ferulic Acid and Vanilla Acid inPolygonum perfoliatumby HPLC

HUANG Jia-yu，LI Li，LIU Qing，SHENG Yu，LIU Yu
（School of Pharmacy，Guiyang Medical College，Guiyang 550004，China）
LUO Tian-jun
（Guizhou Long-range Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang 550018，China）

OBJECTIVE：To develop the method for the simultaneous determination of ferulic acid and vanillic acid inPolygonum perfoliatum.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of 1.0%formic acid-methanol（40∶60）at flow rate of 1.0mL·min-1.The detection wavelength was set at 290nm.RESULTS：The linear range of ferulic acid was 0.6～3.0μg（r＝0.9995）with an average recovery of 99.32%（RSD＝1.06%，n＝9）.The linear range of vanilla acid was 0.454～2.270μg（r＝0.9999）with an average recovery of 99.92%（RSD＝2.17%，n＝9）.CONCLUSION：The method is sensitive，accurate and reproducible for the quality control ofP.perfoliatum.

Polygonum perfoliatum；Ferulic acid；Vanillic acid；HPLC；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2011）19-1783-02

Δ國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題（2009BAI74B02-4）

＊副教授，碩士。研究方向：藥物制劑及中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。電話：0851-6908568。E-mail：gzgyhjy@sohu.com

#通訊作者：副教授，碩士。研究方向：藥物質(zhì)量控制。電話：0851-6908568。E-mail：lili_online@sohu.com

2011-01-14

2011-04-07）