草石蠶莖尖脫毒培養(yǎng)及良種繁育體系

劉弘，崔俊林，譚鵬昊，劉松濤，胡功洧

（1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶萬州，404155；2.重慶大德農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司）

草石蠶莖尖脫毒培養(yǎng)及良種繁育體系

劉弘1，崔俊林1，譚鵬昊1，劉松濤2，胡功洧2

（1.重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶萬州，404155；2.重慶大德農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司）

草石蠶攜帶的病毒能通過繁殖器官代代相傳、蔓延，導(dǎo)致草石蠶種性退化，產(chǎn)量及品質(zhì)下降。結(jié)合筆者對草石蠶多年的研究成果，從病毒為害、莖尖培養(yǎng)、良種繁育等方面綜述了草石蠶的脫毒培養(yǎng)及良種繁育體系，為生產(chǎn)上推廣應(yīng)用草石蠶脫毒良種、提高其產(chǎn)量和品質(zhì)、促進(jìn)草石蠶利用等提供參考。

草石蠶；莖尖脫毒培養(yǎng)；良種繁育

草石蠶 （Stachys sieboldiiMiq.）又名甘露子、地蠶、寶塔菜等，為唇形科水蘇屬多年生草本植物，是我國的特產(chǎn)蔬菜[1～3]，原產(chǎn)于我國北部，現(xiàn)分布在我國南北各地，重慶、江蘇、河北、內(nèi)蒙、陜西和寧夏等地都有種植。草石蠶以地下塊莖供食，其富含蛋白質(zhì)、氨基酸、水蘇糖及多種維生素，營養(yǎng)豐富；經(jīng)鹽漬、醬制加工后風(fēng)味獨(dú)特，為佐餐之佳品。其塊莖不僅可作水果生食或糖漬食，還可入藥，性味甘平，入肺經(jīng)脾，有潤肺益腎、滋陰補(bǔ)血等功效，可治療氣喘、肺虛咳嗽、腎虛腰痛等病癥。

草石蠶難以形成種子，以地下塊莖進(jìn)行無性繁殖。與馬鈴薯類似，病毒侵染草石蠶后，能通過繁殖器官代代相傳、蔓延，導(dǎo)致草石蠶種性退化，產(chǎn)量及品質(zhì)下降。曹鳴慶等[4]已在20世紀(jì)80年代報道了草石蠶的莖尖分生組織培養(yǎng)和脫病毒系的應(yīng)用價值研究成果。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，許多方法得以改進(jìn)。通過對草石蠶病毒病、莖尖組織培養(yǎng)脫毒、脫毒系試管苗離體快繁及保存、脫毒種莖繁育等研究，摸索出一套更經(jīng)濟(jì)有效的草石蠶組培脫毒繁殖技術(shù)，為草石蠶脫毒良種繁育體系建立及商業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 草石蠶病毒病的為害

為害草石蠶的病毒主要有苜蓿花葉病毒（AMV）、煙草花葉病毒（TMV）和一種屬于馬鈴薯Y病毒組的桿狀病毒（粒體長750 nm以下）[4，5]。田間觀察到感病毒植株長勢較差、葉色淡，逆光可見葉綠素分布不均，呈斑駁花葉癥狀。生產(chǎn)上可采用指示植物鑒定、酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和免疫吸附電鏡（ISEM）等方法檢測病毒[6]。酶聯(lián)免疫吸附測定是最常用的病毒檢測方法，它可以在較短時間內(nèi)對大批量樣品同時進(jìn)行定性和定量檢測，并且需要的設(shè)備條件不高，相對費(fèi)用較低，但需要獲得與標(biāo)準(zhǔn)陽性對照相應(yīng)的病毒抗血清。免疫吸附電鏡方法是（有病毒）陽性檢出的最直觀可靠的方法，其靈敏度和專一性均比酶聯(lián)免疫吸附測定方法高，但所需設(shè)備昂貴，費(fèi)用比酶聯(lián)免疫吸附測定方法高。

指示植物鑒定在防蟲網(wǎng)（溫）室內(nèi)進(jìn)行，將被檢標(biāo)樣汁液摩擦接種于指示植物觀察指示植物的表現(xiàn)癥狀。接種時的苗齡因植物不同而不同，豆科植物在2片真葉展開時接種，其他植物可在4～8葉期接種。接種后黑暗或遮光24 h，此后正常光照，7～30 d內(nèi)觀察癥狀表現(xiàn)。煙草花葉病毒和苜蓿花葉病毒在指示植物上癥狀反應(yīng)明顯，詳見表1。

由于草石蠶離體微繁和貯存比較方便，所以只要精確測出少量不含病毒的植株，就可獲得大量脫毒系并長久使用。

2 草石蠶莖尖脫毒培養(yǎng)

2.1 取材、消毒與接種

12月從田間挖取草石蠶塊莖，沖洗干凈，置于培養(yǎng)室內(nèi)催芽，室溫保持（23±2）℃，約2周后，待塊莖頂芽萌發(fā)5 mm左右即可取材；也可于翌年早春，待塊莖正常萌芽時取材。將已萌芽塊莖置于超凈工作臺上，先用70%酒精浸泡30 s，再用2.5%次氯酸鈉（NaClO）溶液浸泡消毒20 min，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸去塊莖表面水分。在40倍雙目解剖鏡下，用解剖針剝離頂芽生長點(diǎn)，切取帶1～2個葉原基、長0.1～0.3 mm的莖尖作為外植體，并迅速接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)，脫毒效果好、成活率高。

若取不帶葉原基的莖尖作外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，則成活率低，并且經(jīng)過愈傷組織階段所產(chǎn)生的苗株變異率會增大。說明葉原基可能提供了莖尖生長和發(fā)育的內(nèi)源激素，利于草石蠶莖尖培養(yǎng)。

2.2 莖尖培養(yǎng)與成苗

表1 病毒在指示植物上的癥狀

草石蠶莖尖初代培養(yǎng)適宜選用MS＋6-BA 0.2～0.3 mg/L＋NAA 0.05～0.1 mg/L＋GA30.1～0.3 mg/L＋白糖3%＋瓊脂0.5%的培養(yǎng)基，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度白天23～25℃，夜間18～20℃，空氣相對濕度保持在70%～80%。莖尖接種初期在黑暗或室內(nèi)自然散射光下培養(yǎng) 3～5 d，然后光照培養(yǎng)，光照時間14 h/d，光照強(qiáng)度1 000～4 000 lx，隨莖尖發(fā)育逐漸增加光照強(qiáng)度。

草石蠶莖尖分生組織培養(yǎng)初期生長緩慢，約2周后可見外植體略長大，約3周后可見莖尖由白色轉(zhuǎn)黃白色，繼而黃綠色，約6周后可見莖尖長成長3～5 mm的淺綠色幼莖，無根分化。繼續(xù)培養(yǎng)，再經(jīng)1個月左右便可長成高3～5 cm、有少量根的完整植株。初代培養(yǎng)基中加入一定量的植物生長調(diào)節(jié)劑對于誘導(dǎo)草石蠶莖尖分生組織再生植株有促進(jìn)作用。其中細(xì)胞分裂素是誘導(dǎo)莖尖產(chǎn)生叢生芽的主要物質(zhì)，但一定要控制濃度，在6-BA濃度高于1.0 mg/L的培養(yǎng)基中，莖尖產(chǎn)生密集叢生芽，成苗雖多，但苗芽細(xì)弱，并容易發(fā)生愈傷組織化，增加植株變異率；添加少量GA3對促進(jìn)莖尖再生植株生長有明顯的效果。

2.3 脫毒試管苗離體擴(kuò)繁

將莖尖再生苗分單株（芽）少量繁殖，進(jìn)行嚴(yán)格病毒檢測，然后選擇無病毒株系即可進(jìn)行大量擴(kuò)繁。草石蠶試管苗繁殖可采取莖段微扦插，將試管苗剪切成帶有1個莖節(jié)及1對葉片，長約1 cm的莖段轉(zhuǎn)接，適宜選擇MS＋白糖3%＋瓊脂0.5%培養(yǎng)基，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)室溫度（25±2）℃，光照時間14 h/d，光照強(qiáng)度3 000～4 000 lx，空氣相對濕度保持在70%～80%。草石蠶試管苗在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中生長良好，約4周即可長成4～6 cm長、有5～7個節(jié)，形成少量根、帶1～3個側(cè)枝的健壯幼苗，并且可反復(fù)繼代，繼代培養(yǎng)達(dá)5 a的試管苗未發(fā)現(xiàn)有變異或玻璃化；當(dāng)添加少量6-BA時，側(cè)芽增多；當(dāng)6-BA濃度提高到1.0 mg/L時，莖的節(jié)間明顯縮短，葉片小，培養(yǎng)4周株高僅2.5 cm左右。

草石蠶試管苗在不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4～5周后就可形成少量細(xì)而長的根，生根能力較強(qiáng)。但若要進(jìn)行出瓶移栽，仍應(yīng)進(jìn)行生根培養(yǎng)，培育健壯根系,以提高移栽成活率。適于生根的培養(yǎng)基為1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋白糖3%＋瓊脂0.55%，pH值5.8～6，培養(yǎng)條件與繼代培養(yǎng)相同。生根培養(yǎng)時應(yīng)根據(jù)試管苗生長情況，配制一定比例的生根培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基，剪取株高5 cm左右的健壯幼苗，去掉細(xì)根，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，其余小苗或莖段轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)擴(kuò)繁或保存，盡量減少浪費(fèi)，以降低生產(chǎn)成本。

草石蠶試管苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)中培養(yǎng) 7～10 d后，可在培養(yǎng)基內(nèi)的莖節(jié)處看見數(shù)條白色、短粗的幼根，待根長1 cm左右，即可進(jìn)行馴化移栽。生根培養(yǎng)階段于1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L+6～10 mg/L PP333培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能促進(jìn)根系發(fā)育，改善根系質(zhì)量，增強(qiáng)幼苗抗逆性，提高移栽成活率，并且移栽后緩苗期短，生長旺盛[7，8]。

2.4 脫毒試管苗保存

試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)室內(nèi)常溫（周年無控溫處理）條件下，草石蠶試管苗在MS培養(yǎng)基中保存1 a以上，培養(yǎng)基已干涸，葉片枯黃，但莖稈或莖尖綠色，剪掉枯葉的綠色莖段或綠色莖尖轉(zhuǎn)接，仍能生長成株，并且無變異發(fā)生。在草石蠶試管苗繼代培養(yǎng)階段以MS為基本培養(yǎng)基，添加8～10 mg/L PP333或600～800 mg/L CCC能使試管苗明顯矮化，莖節(jié)粗壯，試管苗的保存期可延長至4～5個月[7，8]。因此，生產(chǎn)上可采用添加植物生長調(diào)節(jié)劑和降低培養(yǎng)室溫度等方法，延長試管苗保存時間，減少繼代次數(shù)，以便根據(jù)需要合理安排生產(chǎn)，節(jié)省人力、物力，降低生產(chǎn)成本。

3 草石蠶脫毒種繁育

草石蠶脫毒種繁育可分為原種生產(chǎn)和良種生產(chǎn)兩個階段。與馬鈴薯脫毒種生產(chǎn)相同，在原種生產(chǎn)和良種生產(chǎn)階段都要進(jìn)行嚴(yán)格的隔離保護(hù)，以防止病毒再侵染。

草石蠶為短日照植物，不耐高溫干旱，喜陰怕澇，遇霜枯死。自然生長條件下以地下莖越冬，翌年3月初（驚蟄前后），溫度在8℃以上開始萌芽生長；4月中旬（清明后）溫度15℃左右出土，葉片展開；6月下旬（夏至后）生長速度加快，地上部分從莖頂端至葉腋先后開花，隨后地下逐漸抽出匍匐莖；9月中下旬（秋分左右）地上部分生長緩慢，同化養(yǎng)分積累，地下匍匐莖頂端開始膨大，形成螺旋狀塊莖；12月上旬（大雪）過后，地上部分遇霜枯萎，即可收獲塊莖[9]。生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)草石蠶生長習(xí)性及各地氣候特點(diǎn)，合理安排生產(chǎn)時期。

3.1 原種生產(chǎn)

原種生產(chǎn)即是將無病毒的試管苗在隔離保護(hù)條件下快速繁殖，生產(chǎn)微型種莖。一般在3月下旬，氣溫穩(wěn)定在15℃以上，即可安排草石蠶生根試管苗出瓶生產(chǎn)原種。

①基質(zhì)的選擇與處理 脫毒草石蠶試管苗的移栽基質(zhì)要求疏松、透氣性良好，可用蛭石（或珍珠巖）與泥炭土按1∶1混合，或河砂與腐殖質(zhì)土按2∶1混合作基質(zhì)，也可在苗床表層鋪7 cm左右蛭石（或珍珠巖），下面鋪過篩的肥沃、砂壤質(zhì)園土，再在底層鋪5 cm厚粗砂或炭渣，以便透氣、濾水。基質(zhì)需嚴(yán)格消毒，可采取高溫處理或甲醛、硫磺薰蒸，以防病蟲為害、雜菌感染、雜草滋生。栽前1～2 d基質(zhì)澆透水，使其沉實(shí)，栽苗時保持土壤濕度達(dá)60%左右。

②生根試管苗馴化、移栽及管理 將草石蠶生根試管苗培養(yǎng)瓶移入防蟲溫（網(wǎng)）室內(nèi)，置于散射光下煉苗3～5 d，再打開瓶蓋煉苗3 d，待試管苗葉色變深、莖稈增粗、根伸長且由淺黃色變成深棕色，即可進(jìn)行移栽。移栽時將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，用清水洗凈基部附著的培養(yǎng)基，置于50%多菌靈800～1 000倍液中浸泡1～2 min，再按約10 cm×10 cm的株行距栽入苗床基質(zhì)內(nèi)。移栽后葉面噴水，覆蓋塑料薄膜和遮陽網(wǎng)，避免陽光直射，保持相對濕度在90%以上，但也不能造成基質(zhì)積水，以免引起爛根死苗。約15 d，待移栽苗開始發(fā)新根和出新葉后，再逐漸揭開遮陽網(wǎng)，適當(dāng)減少澆水量，一般25 d后成活率可達(dá)95%以上。徐夢等[10]報道，剪取具有一個生長點(diǎn)、長2 cm左右的草石蠶無根試管苗莖段，把下部切口放到90 mg/L的IAA溶液中處理5 min，扦插到已經(jīng)澆透水的苗床基質(zhì)中，接著噴霧水定根，再按照與移栽生根試管苗相同的環(huán)境條件進(jìn)行管理，15 d后試管苗扦插成活并正常生長，30 d后成活率為92%。因此，在草石蠶脫毒原種生產(chǎn)過程中，可在試管苗出瓶移栽后反復(fù)剪苗扦插，以加快繁殖速度，減少室內(nèi)試管苗生產(chǎn)量，有效降低生產(chǎn)成本。

試管苗移栽或扦插苗成活后，長出3～4片新葉，5月上中旬即可移栽到防蟲網(wǎng)室土壤中。草石蠶對土壤要求較嚴(yán)格，在黏土中種植不利塊莖膨大，且收獲時容易損傷塊莖表皮，使其褐變，影響品質(zhì)；宜在土層深厚、富含有機(jī)質(zhì)、肥沃、排水良好的砂壤土種植。栽植前用磷肥與草木灰混合均勻拌入土中作底肥，土壤要充分消毒，以防止病蟲害發(fā)生。待苗高15 cm時，于高于地面10 cm處摘心，以促發(fā)側(cè)枝，現(xiàn)蕾后及時摘除花蕾，以減少養(yǎng)分消耗。根據(jù)苗情，于6月中旬、9月下旬用尿素追肥2次，在地下莖膨大期可葉面噴施磷酸二氫鉀液，以利塊莖形成、膨大。

③塊莖采收與保存 11月下旬至12月上旬，待草石蠶地上部植株自然枯黃后即可采收，挖取地下塊莖后，清除粘附其上的泥土，用清水洗凈，注意不要擦傷表皮，再用50%多菌靈1 000倍液浸泡約20 min后，晾干，置于低溫、通風(fēng)、干燥條件下保存。不足1 g的細(xì)小塊莖，容易失水干枯，不便貯藏，也可留于土中，待翌年春季萌發(fā)后直接選苗移栽作種。

3.2 良種生產(chǎn)

良種生產(chǎn)是在隔離保護(hù)條件下用原種進(jìn)行1～2代擴(kuò)繁，生產(chǎn)大田用商品種莖。

①良種繁殖地選擇 繁殖良種用地面積增大，可能大部分地區(qū)都不具備完全利用防蟲網(wǎng)室進(jìn)行隔離種植的生產(chǎn)條件。草石蠶原生于海拔3 200 m的濕潤地。因此，可利用氣候冷涼、常遇大風(fēng)多霧天氣，蚜蟲少，有翅蚜蟲不易飛遷、降落的高海拔地區(qū)繁殖良種，以降低生產(chǎn)成本。還可利用林中的空地、四周環(huán)山的平地等天然隔離條件好，且無土傳病害的地塊繁殖良種。種莖繁殖田忌連作，還必須遠(yuǎn)離蔬菜、油菜和煙草等種植地，同時，還應(yīng)嚴(yán)格土壤消毒，嚴(yán)防病蟲害發(fā)生。可采取生石灰消毒，結(jié)合施基肥撒施生石灰1 000 kg/hm2于土壤表面，然后進(jìn)行翻耕整地。

②適時播種、移栽及防治病蟲害 草石蠶良種生產(chǎn)應(yīng)根據(jù)各地氣候特點(diǎn)適時播種、培育壯苗，并適時移栽、合理密植。良種生產(chǎn)可適當(dāng)比商品塊莖生產(chǎn)的種植密度大一些，可按株行距0.33 cm×0.33 cm，種植密度為90 000株/hm2左右。適當(dāng)提高種植密度，可控制塊莖單個質(zhì)量，增加塊莖數(shù)量。目前，草石蠶的主要病害除病毒病以外還有腐爛病，經(jīng)鑒定該病原菌為尖孢鐮刀菌 （Fusarium oxysporum Schlecht）[11，12]。腐爛病發(fā)生后應(yīng)及時清除病株，并用石灰消毒土壤，發(fā)病初期可選用50%霉菌凈或50%多菌靈800～1 000倍液噴霧，或用50%敵克松800倍液灌根。可選擇速滅殺丁、樂果等藥交替使用防治蚜蟲、紅蜘蛛等。

綜上所述，將草石蠶組培脫毒種繁育體系建立圖示如下（圖1）。

4 結(jié)論

目前，草石蠶在國內(nèi)尚屬稀特名菜，分布雖廣，但栽培面積不大，稍成規(guī)模的有江蘇揚(yáng)州、河南偃師、湖北荊門、山東濰坊、重慶黔江等地，但產(chǎn)量較低。草石蠶腌漬加工產(chǎn)品在部分商場、餐廳少有提供，雖受喜愛，但數(shù)量有限。由于沒有充足的產(chǎn)品供人們鮮食，還未形成食用習(xí)慣。草食蠶加工產(chǎn)品出口暢銷東南亞市場，但規(guī)模仍然很小。我國草石蠶生產(chǎn)發(fā)展緩慢，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國內(nèi)外市場的需求。究其原因，主要是由于草食蠶種植普遍粗放，品種退化嚴(yán)重，導(dǎo)致產(chǎn)量較低，并且塊莖小、加工品質(zhì)差，加之生育期較長，種植成本較高，經(jīng)濟(jì)效益不佳，因而影響了農(nóng)民種植積極性。因此，通過組織培養(yǎng)途徑建立草石蠶無病毒良種繁育體系，并在生產(chǎn)上廣泛推廣應(yīng)用脫毒良種，使草石蠶生產(chǎn)進(jìn)入良性循環(huán)，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，是促進(jìn)草石蠶生產(chǎn)發(fā)展的有效途徑。

圖1 草石蠶組培脫毒種繁育體系

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Virus-free Culture of Shoot-tip Tissue and Propagation of High Quality Cultivar ofStachys sieboldiiMiq.

LIU Hong1,CUI Junlin1,TAN Penghao1,LIU Songtao2,HU Gongyou2
(1.Chongqing Three Gorges Polytechnic College,Wanzhou 404155; 2.Chongqing Dade Agricultural Development Co.,Ltd.)

The virus inStachys sieboldiiMiq.can spread from generation to generation through the reproductive organs, which results in the degeneration of cultivar,reduction of yield and decline of quality.To increase the yield and quality ofS.sieboldiiMiq.,and to promote the application ofS.sieboldiiMiq.and its virus-free high quality cultivar,the damage situation of the virus,virus-free culture of the shoot-tip tissue,and propagation system of the high quality cultivar were summarized on the basis of the authors'research achievements.

Stachys sieboldiiMiq.;Virus-free culture with shoot-tip tissue;Propagation of high quality cultivar

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.22.006

重慶三峽職業(yè)學(xué)院2007年度科學(xué)研究計劃項(xiàng)目——特菜草石蠶開發(fā)研究

劉弘（1958-），女，副教授，從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)教學(xué)與研究，電話：13658208688，E-mail：lihongyi_333@hotmail.com

2011-08-24