鴉膽子油乳注射液對SKMG-4膠質瘤細胞的作用研究

楊利輝，石文建，趙喜慶，汪洪江

（華北煤炭醫學院附屬人民醫院神經外科，河北 唐山 063000）

鴉膽子油乳注射液對SKMG-4膠質瘤細胞的作用研究

楊利輝，石文建，趙喜慶，汪洪江

（華北煤炭醫學院附屬人民醫院神經外科，河北 唐山 063000）

目的 本實驗擬研究鴉膽子油乳注射液對人腦膠質瘤細胞SKMG-4細胞生長抑制及誘導細胞凋亡的作用。方法 體外培養人腦膠質瘤細胞SKMG-4，利用MTT比色法檢測鴉膽子油乳注射液對于SKMG-4的增殖抑制影響；用流式細胞術（flowcytometry，FCM）分析藥物處理前后SKMG-4的細胞周期變化；實時熒光定量pcr檢測不同處理組中凋亡基因bcl-2的表達。結果 MTT顯示鴉膽子油乳注射液對SKMG-4細胞增殖抑制作用呈劑量依賴性，當濃度為5 g/L時，對SKMG-4細胞增殖的抑制率達到（72.1±2.2）%（P＜0.05）；流式細胞儀分析顯示，用5 g/L鴉膽子油乳注射液培養48 h，細胞周期中G1期所占比例增高，S期占細胞周期的比例降低；實時熒光定量pcr結果顯示隨著鴉膽子油乳注射液的濃度增加凋亡基因bcl-2mRNA的表達逐漸減少。與對照組比較P＜0.01。結論中藥鴉膽子油乳注射液可顯著抑制SKMG-4膠質瘤細胞細胞增殖及促進其凋亡。

鴉膽子油乳注射液；人腦膠質瘤；Bcl-2；凋亡

鴉膽子是苦木科植物鴉膽子的成熟果實的提取物，研究發現其對癌細胞有較高親和力，單獨應用可以抗癌，具有扶正固本作用；聯合放、化療有增效減毒的作用；提高機體免疫力；保護骨髓造血功能，提升外周血象；毒性小、副作用小，臨床應用安全。本實驗通過體外實驗驗證了鴉膽子油乳注射液對膠質瘤細胞的抑制作用。

1 材料

1.1 細胞株

人腦膠質瘤細胞SKMG-4株有中山大學附屬腫瘤醫院神經外科惠贈。

1.2 藥品及試劑

鴉膽子油乳注射液購自沈陽藥科大學制藥廠（每支10mL，含鴉膽子油乳1 g）DMEM（HighGlycose）液體培養基購自Hyclone公司，胎牛血清，MTT、碘化丙啶（PI）、二甲亞砜均購自Sigma公司，兔抗人Bcl-2、SABC法免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。實時熒光定量PCR試劑盒購自天根公司。

2 方法

2.1 MTT比色法檢測鴉膽子油乳注射液對細胞的增殖抑制

收集對數生長期細胞，用DMEM（含10%新生牛血清）細胞培養液調整細胞濃度為1×104/mL的細胞懸液，加入96孔圓底細胞培養孔內，每孔0.1 mL，置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下常規培養12 h后,實驗組加入0.1 mL鴉膽子油乳注射液使藥物終濃度分別為5 g/L、2.5 g/L、1.25 g/L、0.625 g/L，每組設5個復孔，對照組除未加鴉膽子油乳注射液外，其余條件完全一致。37℃飽和濕度、5%CO2條件下培養48 h后，加入pH7.4 PBS配制的5 g/L MTT 20μL/孔，再置37℃、5%CO2條件下4 h。取出，吸取上清液。加入DMSO 0.2 mL/孔，混勻30 min后在酶聯檢測儀上570 nm波長處測A570值，以A570間接反映存活細胞數量。據此可推測各濃度鴉膽子對膠質瘤細胞的抑制率，抑制率=（A對照組-A用藥組）/A對照組×100%。

2.2 流式細胞儀分析細胞周期變化

分別收集不同藥物濃度處理組和對照組處理48 h的SKMG-4細胞，均勻打散，PBS清洗1次，用預冷的70%乙醇重懸，且在4℃過夜。PBS清洗2次，分別加入PI（400 mg/mL）和RNaseA（1 mg/mL）各50 μL。4℃靜止30 min，然后上流式細胞儀進行周期分析。

2.3 實時熒光定量pcr檢測不同處理組中凋亡基因bcl-2的表達

將調整至同一濃度的各組總RNA分別逆轉錄合成cDNA，以β-actin為內對照進行實時熒光定量pcr，基因引物序列（表1）。首次循環先在95℃變性2 min，然后變性、退火、延伸分別為95℃ 20 s，58℃ 25 s，72℃ 30 s，共45個循環，最后72℃延伸5 min。根據CT值計算出對照組基因和處理組基因的ΔCT，再用對照組ΔCT-處理組ΔCT得到ΔΔCT，最終根據2-（ΔΔCT）得出處理組樣本基因相對于對照組樣本基因的量。

表1 基因引物序列

3 結果

3.1 鴉膽子油乳注射液對SKMG-4細胞增殖抑制作用

鴉膽子油乳注射液對SKMG-4細胞的增殖抑制作用呈現劑量依賴性。當濃度為5 g/L時對膠質瘤的抑制率為（72.1±2.2）%，與對照組相比P＜0.05。隨著藥物濃度的降低對膠質瘤的抑制率隨之降低，當濃度為0.625 g/L時抑制率為（16.0±2.5）%，與對照組相比P＜0.05（表2）。

3.2 流式細胞儀對細胞周期的作用

隨著鴉膽子油乳注射液濃度的增加，細胞周期中G1期的比例逐漸增加，S期的比例逐漸減小，說明鴉膽子油乳注射液對SKMG-4的抑制再G1期（表3）。

3.3 鴉膽子油乳注射液對SKMG-4細胞bcl-2基因表達的影響

表2 不同濃度的鴉膽子對SKMG-4細胞抑制情況（n=5，）

表2 不同濃度的鴉膽子對SKMG-4細胞抑制情況（n=5，）

注：與對照組相比，*P＜0.05。

組別 濃度（g/L） A570 抑制率（%）對照組 0 0.65±0.02 0藥物組 5 0.24±0.01* 72.1±2.2*2.5 0.33±0.02* 56.4±3.4*1.25 0.46±0.02* 33.6±3.6*0.625 0.56±0.01* 16.0±2.5*

表3 不同濃度的鴉膽子對SKMG-4細胞周期分布的影響（n=5，）

表3 不同濃度的鴉膽子對SKMG-4細胞周期分布的影響（n=5，）

注：與對照組相比，*P＜0.05；**P＞0.05。

組別 濃度（g/L） G1% S%對照組 0 57.8±0.3 29.4±0.3藥物組 5 71.3±0.5 * 11.7±0.3*2.5 67.5±1.1 * 17.3±0.3*1.25 63.4±0.2 * 21.6±0.2*0.625 59.2±0.2 ** 25.1±0.2**

隨著鴉膽子油乳注射液作用濃度的增加，SKMG-4細胞的bcl-2基因的mRNA表達明顯減少，與對照組相比P＜0.01（表4）。

表4 不同藥物濃度處理的SKMG-4細胞中bcl-2mRNA的表達（n=5，）

表4 不同藥物濃度處理的SKMG-4細胞中bcl-2mRNA的表達（n=5，）

注：與對照組相比，*P＜0.01。

組別 濃度（g/L） 2-ΔΔCT對照組 0 1藥物組 5 0.025±0.004*2.5 0.076±0.005*1.25 0.186±0.029*0.625 0.771±0.074*

4 討論

鴉膽子為苦木科植物的成熟果實，鴉膽子油乳以鴉膽子石油醚提取物為原料，以精制大豆磷脂為乳化劑制成的水包油乳劑。研究表明，鴉膽子油乳可促進骨髓干細胞形成，與放療和／或化療聯合用有一定的防止白細胞和血小板降低的作用[1]。臨床上鴉膽子油乳已聯合化、放療已廣泛應用于肺癌[2-3]、肝癌[4]、食管癌[5]、胰腺癌[6]等多種惡性腫瘤的治療。但對膠質瘤的研究較少。

此實驗通過MTT比色法、流式細胞法、實時熒光定量PCR觀察鴉膽子油乳注射液對膠質瘤SKMG-4細胞生長的影響。MTT結果表明隨著鴉膽子油乳注射液濃度的增加，對SKMG-4細胞增值抑制作用逐漸增強。當藥物濃度為5 g/L時，對膠質瘤細胞有明顯的抑制率為（72.1±2.2）%，與對照組比較P＜0.05，而濃度為0.625 g/L時藥物對膠質瘤的抑制作用較弱為（16.0±2.5）%（P＜0.05）。說明鴉膽子油乳注射液對膠質瘤的抑制呈劑量依賴型。

正常細胞周期主要由G1、S、G2和M期組成。其中以G1～S期轉換和G2～M期轉換最為重要。而G2～M調定點被認為是腫瘤治療敏感性的主要決定因素[7]。此實驗研究表明，隨著鴉膽子油乳注射液的濃度增加，G1期占細胞周期的比例逐漸增加，S期占細胞周期的比例逐漸減低。G1期的增加說明鴉膽子油乳注射液使膠質瘤細胞停止在G1期。S期即DNA合成期，可反應細胞的增殖情況。S期占細胞周期的比例高,則提示DNA合成活躍。一般而言，腫瘤細胞的S期比例較正常細胞要高，其增殖活性也較正常細胞高[8]。流式細胞分析顯示隨著藥物濃度的增加G1期逐漸增加，S期逐漸降低，與對照組相比，P＜0.05。推測鴉膽子油乳注射液可能在S期抑制DNA的合成，從而使腫瘤細胞停滯在G1期。

近年來，凋亡（apoptosis）在腫瘤發生中的作用日益受到重視。bcl一2蛋白作為一種抑制凋亡因素調節腫瘤細胞凋亡，研究表明其異常增加可抑制其它促凋亡因素的作用[9]。Bcl-2基因處于凋亡調控的終末部分，通過抑制腫瘤細胞的凋亡，可使腫瘤細胞生存時間延長，在腫瘤的發生、發展中起重要的作用[10-13]。大量研究表明，Bcl-2表達情況與腦膠質瘤的分級和預后有相關性，并且Bcl-2表達還牽涉到腫瘤對放、化療的敏感性。本實驗通過實時熒光定量分析顯示隨著鴉膽子油乳注射液的增加bcl-2mRNA的表達逐漸減少，當濃度為10 mg/L時，bcl-2mRNA表達為0.025±0.004，與對照組比較P＜0.01，說明鴉膽子油乳注射液可通過抑制bcl-2表達來促進細胞的凋亡。

此實驗明確了鴉膽子油乳注射液對膠質瘤細胞有明確的抑制生長作用，誘導細胞凋亡，阻滯細胞生長周期于G1期是其抗瘤的重要機制，抑制bcl-2基因的表達在一定程度上參與了這一過程。但此實驗只是在體外環境下研究鴉膽子油乳注射液抑制膠質瘤細胞的生長情況。由于體內環境的特殊性，鴉膽子油乳注射液能否在體內發揮作用將是我們進一步研究的目標。

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Brucea javanica oil emulsion injection to dare crow SKMG-4 glial cells research

YANG Li-hui,SHI Wen-Jian,ZHAO Xi-qing,WANG Hong-jiang
(People Hospital Affi liated Noth China Coal Medical College Hebei Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To explore the effect of brucea javanica oil emulsion on apoptosis and restrain the grow of human glioma SKMG-4.Methods cultured human SKMG-4 glioma cells.Using MTT colorimetric assay to measure the inhibitory effect on proliferation of brucea javanica oil emulsion for SKMG-4 golima.Using flow cytometry analysis of drug treatmeat before and after the cycle of SKMG-4 glioma cells.Using real-time quantitative PCR to measure the express of bcl-2 in different group.Results The result of MTT showed the restrain of brucea javanica oil emulsion for SKMG-4 glioma are dose-dependent.When the consistence is 5g/l,the proliferation rate is(72.1±2.2)% (P＜0.05).Flowcytometry analysis showed that,with 10g/L brucea javanica oil emulsion cultured 48h,cell cycle G1 phase proportion increased,S phase cell cycle reduction in the proportion accounted for.Real-time quantitative PCR show with the increasing of brucea javanica oil emulsion the express of bcl-2mRNA becoming lower and lower.Compared with contrast group P＜0.01.Conclusion The brucea javanica oil emulsion can remarkably restrain the multiplication of SKMG-4 glioma and promote the cell to apoptosis.

Brucea Javanica Oil Emulsion;Golima;Bcl-2;Apoptosis

R739.41

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.008.022.03

2011－02－07

楊利輝（1984－），男，河北邢臺人，在讀碩士研究生，主要從事膠質瘤的化療工作。

馬宏宇）