心肌炎小鼠心肌纖維化與心臟上皮/內皮間充質轉化的關系*

張召才， 嚴 靜， 虞意華， 顏默磊， 呂曉春

(浙江醫院ICU，浙江 杭州310013)

心肌纖維化是病毒性心肌炎常見病理變化，是患者出現心律失常、心功能減退甚至心臟性猝死等并發癥的重要原因［1］。既往認為心臟原位(heartresident)的成纖維細胞(fibroblast，Fb)受炎癥等刺激后增生、活化產生膠原和非膠原性細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是心肌纖維化形成的核心事件。近年來研究表明:心臟成纖維細胞(cardiac fibroblast，cFb)有多個來源，除心臟原位cFb外，骨髓和心臟組織中的上皮/內皮細胞均是 cFb的來源［2-4］，后者通過上皮/內皮間充質轉化(epithelial/endothelial to mesenchymal transition，EMT/EndMT)可以轉變成為cFb［2，5］。心外來源的cFb與心肌纖維化的關系日益受到關注，在自身免疫性心肌炎模型中發現骨髓來源的 cFb約占所有 cFb的60%［3，4］;目前尚不清楚EMT/EndMT是否與病毒性心肌炎心肌纖維化有關，本文對此進行研究和探討。

材料和方法

1 試劑和儀器

1.1 試劑 天狼星紅(Sirius red，F3BA，Fluka Chemie);轉化生長因子(transforming growth factor β1，TGF- β1)、Wnt1、Twist1、血管內皮細胞鈣黏素(VE-cadherin)、上皮細胞鈣黏素(E-cadherin)、成纖維細胞特異蛋白(fibroblast specific protein-1，FSP-1)、α-平滑肌肌動蛋白(α -smooth muscle actin，α-SMA)和內參照α-微管蛋白(α-tubulin)Ⅰ抗均購自 Santa Cruz。Ⅱ抗購自 Jackson。膠原前肽ELISA試劑盒購自上海藍基生物科技公司。Trizol試劑盒購自Invitrogen。Western blotting ECL試劑盒購自Pirece。PVDF免疫印跡轉移膜購自Millipore。逆轉錄試劑盒購自Promega。聚丙烯酰胺凝膠購自上海碧云天生物公司。

1.2 主要儀器和軟件 ABI Prism 7700序列測定儀(ABI);HRD-045-NIK尼康照相系統(尼康);凝膠掃描分析系統(Total lab)。

2 方法

2.1 建立動物模型 雄性、6周齡、純種近系BALB/c小鼠36只(購自上海斯萊克實驗動物公司，平均體重20-25 g，隨機分為2組:對照組(control，n=16)和病毒性心肌炎組(viral myocarditis，VMC，n=20)。對照組每周腹腔注射1次無菌病毒培養液(EMEM)0.1 mL;心肌炎組每周腹腔接種1次0.1 mL 109倍50%組織培養感染劑量(50%tissue culture infection dose，TCID50)柯薩奇病毒B3(Coxsackievirus B3，CVB3，Nancy株)，復制急、慢性病毒性心肌炎模型。7 d后從2組中隨機選取活鼠各8只處死取樣;余小鼠繼續腹腔注射和自然喂養直至第30 d，統計最后存活小鼠數。

2.2 標本處理 在上述各組小鼠達到觀察時點時，隨機取心肌炎組與對照組小鼠各8只，行心臟超聲檢查心功能，然后處死小鼠。所有存活小鼠均取血并提取血清置入-20℃冰箱凍存待測;心臟組織切成2塊，分別用于組織病理學檢測(10%中性甲醛PBS固定)、基因檢測(-70℃凍存)和蛋白檢測(-40℃凍存)。

2.3 組織病理學檢測 甲醛固定的標本經脫水、清洗后以石蠟包埋，其后制成0.4μm厚切片，常規HE染色并行Picrosirius red膠原特異染色后鏡檢。拍片后，取8個不重復視野以自動化照相系統定量分析病變程度和計算膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)。

2.4 血清學檢測 應用ELISA檢測如下膠原前肽:III型前膠原氨基端前肽(aminoterminal propeptide of typeⅢ procollagen，PⅢNP)、I型前膠原氨基端前肽(aminoterminalpropeptide oftype Iprocollagen，PINP)和 I型前膠原羧基端前肽(carboxyterminal propeptide of type I procollagen，PICP)，以評價心臟組織中I型和Ⅲ型膠原代謝情況。操作嚴格參照說明書進行，主要步驟包括:標本激活、建立標準曲線、加樣、加酶標抗體、加底物工作液、終止液和顯色等，最后在492 nm處測吸光度值(A值)，根據各樣品A值在標準曲線上查出所測指標的含量。

2.5 實時RT-PCR檢測 從每組隨機選擇6份心肌標本，以Trizol試劑提取總RNA，采用紫外分光光度法測定RNA樣品在波長260 nm和280 nm的紫外吸收值，計算 A260/A280確認其純度和濃度。取2 μg總RNA應用逆轉錄試劑盒兩步法合成cDNA第1鏈;將所得cDNA稀釋30倍后取3 μL分別加入預先合成的前向和逆向引物各1 μL和5 μL subgreen mix組成10 μL實時RT-PCR反應體系，RT-PCR程序為:50℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，95℃ 15 s，共40個循環。反應結束后確認real-time PCR的擴增曲線和融解曲線，計算Ct值(threshold cycle)，采用比較Ct值方法以β-actin為內參照相對定量各檢測基因的表達水平。每一實驗至少重復3次。所有引物均委托上海生工生物公司設計和合成，見表1。

表1 檢測目標基因所有引物序列Table 1.Primer sequences for detection of target genes

2.6 Western blotting檢測 以Trizol試劑盒抽提心肌樣品總蛋白，各取10 μL蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，印跡轉染PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的0.05%Tween-20/PBS封閉液在室溫下孵育1 h以去除非特異結合部份，封閉液中分別加入2 μL抗 TGF-β1、Wnt1、Twist1、VE-cadherin、E-cadherin、FSP-1、α-SMA和內參照α-tubulin抗體，4℃過夜。加入3 μL第Ⅱ抗體后，用Western blotting ECL試劑盒檢測免疫復合物，照相顯影后經Total Lab 1.11凝膠掃描分析系統進行灰度掃描并作半定量分析。

3 統計學處理

結 果

1 小鼠存活率與組織病理學檢查結果

除外第7 d處理的小鼠(每組8只，共16只)，第30 d，剩余小鼠中心肌炎組存活9只(9/12)，對照組8只均存活(8/8)。HE染色:第7 d，局部心臟可見炎癥細胞浸潤，心肌細胞壞死，心肌纖維斷裂;第30 d，炎癥細胞數減少，纖維組織替代部分壞死心肌，心肌細胞體積增大，排列紊亂，核大深染、異形，心肌纖維基本完整。此病理改變提示急、慢性病毒性心肌炎模型成功建立并均出現心肌纖維化，與我們此前報道的結果一致［6］。

2 血清膠原前肽檢測結果

心肌炎組小鼠血清膠原前肽產生明顯增高，與CVF變化相一致，提示急、慢性心肌炎小鼠均出現心肌纖維化，見表2。

3 急性心肌炎心臟中發生EMT/EndMT

在基因和蛋白表達水平均證實急性心肌炎(第7 d)小鼠心臟中發生EMT/EndMT，特征為上皮/內皮細胞表型標志(E-cadherin和VE-cadherin)丟失，表達明顯下調;間充質蛋白(FSP-1和α-SMA)產生增多，表達顯著上調，伴誘導性細胞因子 TGF-β1、轉錄因子Wnt1、Twist1等表達增加，同時膠原合成增強(CVF和膠原前肽升高)，與心肌纖維化變化一致，見表2、3和圖1。

4 慢性心肌炎心肌中未再發現EMT和EndMT

在基因和蛋白水平均證實慢性感染(第30 d)小鼠心臟中未再發現EMT/EndMT，雖然 FSP-1和α-SMA 的表達仍然顯著上調，TGF-β1、Wnt1、Twist1等因子表達增加，心肌纖維化仍然明顯，但E-cadherin和VE-cadherin表達水平未見下調，表2、3和圖2。

表2 小鼠血清膠原前肽和心臟膠原容積分數的比較Table 2.Comparison of serum procollagen propeptides and cardiac collagen volume fraction(CVF)in mice(±s)

表2 小鼠血清膠原前肽和心臟膠原容積分數的比較Table 2.Comparison of serum procollagen propeptides and cardiac collagen volume fraction(CVF)in mice(±s)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs control.

Control-day 7 8 1.7 ±0.7 1.9 ±0.4 19 ±3 3.0 ±0.7 VMC-day 7 8 3.1 ±0.2＊＊ 2.7 ±0.6* 32 ±9* 18.9 ±2.0＊＊Control-day 30 8 2.0 ±0.6 1.7 ±0.5 22 ±7 2.9 ±1.2 VMC-day 30 9 1.8 ±0.5 2.8 ±0.3* 37 ±5＊＊ 17.3 ±3.4＊＊

討 論

EMT是胚胎期器官形成發育過程中的重要事件，EndMT是其特殊表現形式，近年來發現EMT/EndMT參與了病理性器官纖維化，包括腎、肺、肝、腸和心肌纖維化等［2，5，7，8］。腎損傷后纖維化時腎臟 Fb有 14%-15%來自骨髓、36%經由 EMT 而來［7，8］;在壓力超負荷和慢性移植排斥大鼠模型中發現:27%-35%心臟Fb經由EndMT而來［2］。本研究發現，僅在急性病毒感染時小鼠心臟同時出現EMT和EndMT，伴心肌纖維化形成;慢性病毒感染時，心肌纖維化依然明顯，但未見EMT和EndMT伴隨。

急性病毒感染時小鼠心臟出現EMT和EndMT的原因考慮與心臟上皮/內皮細胞屏障受損、細胞連接破壞有關。上皮/內皮受損引起TGF-β1、Wnt1、Twist1等的表達上調，可以促使上皮/內皮細胞向間充質細胞的轉變、加速膠原的形成，有利于限制炎癥反應、減輕組織器官損傷［8，9］，因此急性期心肌纖維化常常被認為是有益的修復性纖維化，此時膠原的合成和降解同時增強，有利于使心臟炎癥局限化［6］。有人認為急性期心肌纖維化不宜干預，但在臨床實踐中發現:治療急性心肌炎時，控制炎癥反應、保護心肌等措施往往也會減輕心肌纖維化，與心肌纖維化有關的心力衰竭、心律失常、心臟性猝死等并發癥的發生率均會下降［10］，從這一點看來似乎有又干預的必要。本研究結果給干預急性心肌炎帶來了新的思路，在治療急性心肌炎時，除采取抗感染、抗病毒、免疫抑制、抗心衰、抗心律失常等［10］之外，如果增加上皮/內皮細胞保護和干細胞治療等措施，有可能進一步改善預后和減輕纖維化，減少近期和遠期并發癥的發生［11，12］，但其臨床有效性和安全性需要進一步驗證。

Figure 1.Cardiac EMT/EndMT proteomes expression in mice with acute viral myocarditis.A:expression of EMT/EndMT proteomes detected by Western blotting;B:relative expression ratio of EMT/EndMT proteomes between the 2 groups.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖1 急性病毒性心肌炎小鼠心臟EMT/EndMT蛋白質組的表達

Figure 2.Cardiac EMT/EndMT proteomes expression in mice with chronic viral myocarditis.A:expression of EMT/EndMT proteomes detected by Western blotting;B:relative expression ratio of EMT/EndMT proteomes between the 2 groups.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 慢性病毒性心肌炎小鼠心臟中EMT/EndMT蛋白質組的表達

表3 急、慢性期2組小鼠EMT/EndMT相關基因表達水平的比較Table 3.Comparison of relative mRNA expression levels of EMT/EndMT-related genes between the 2 groups of mice in acute and chronic stage(±s.n=6)

表3 急、慢性期2組小鼠EMT/EndMT相關基因表達水平的比較Table 3.Comparison of relative mRNA expression levels of EMT/EndMT-related genes between the 2 groups of mice in acute and chronic stage(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Group VE-cadherin E-cadherin TGF-β1 Wnt1 Twist1 FSP-1 α-SMA Control-day 7 8.3 ±1.2 9.5 ±1.7 4.5 ±0.9 4.5 ±1.1 5.2 ±1.4 6.0 ±1.1 3.7 ±0.8 VMC-day 7 4.6 ±1.1＊＊ 3.9 ±1.0＊＊ 8.9 ±1.9＊＊ 9.5 ±1.3＊＊ 12.1 ±2.1＊＊ 13.6 ±1.8＊＊ 9.6 ±1.4＊＊Control-day 30 9.2 ±1.6 10.3 ±1.5 3.8 ±1.1 3.8 ±0.8 3.1 ±0.3 3.5 ±0.7 2.6 ±0.1 VMC-day 30 10.3 ±1.9 15.5 ±2.3* 8.5 ±1.7＊＊ 9.5 ±1.9＊＊ 6.8 ±1.0＊＊ 8.0 ±1.5＊＊ 7.8 ±1.2＊＊

慢性期未出現EMT/EndMT可能是因為受損的內皮/上皮已經完成自我修復更新，此時TGF-β1、Wnt1、Twist1等的活躍表達可能通過影響心臟原位的或骨髓來源cFb的活動而促進心肌纖維化形成［8，10，11］。這一結果一方面說明慢性心肌炎心肌纖維化的發生機制與急性期有很大差異，另一方面提示對慢性期心肌纖維化的干預要尋找新的切入點。干預慢性心肌炎心肌纖維化時除了針對TGF-β1和Wnt1的刺激因素如病原體、神經體液因子、機械牽拉等［9］之外，還可以考慮采取措施直接抑制或拮抗TGF-β1和Wnt1，以及針對 TGF-β1/Smad通路和Wnt1/β-catenin信號通路中的重要信號分子進行干預。TGF-β1和Wnt1均是促纖維化的重要信號分子，TGF-β1可以調控間質細胞、炎癥細胞和產膠原細胞的交互作用，在多種器官纖維化過程中起關鍵作用，抑制 TGF-β1可以明顯改善器官纖維化［9，13］;TGF- β1/Smad 和 Wnt1/β -catenin 兩大信號通路系統在肺纖維化時已經發現有協同作用［14］。據此推測在我們的心肌炎模型中TGF-β1/Smad和Wnt1/β-catenin兩大信號通路系統的關鍵因子TGF-β1和Wnt1同時上調也可能是一種協同效應，因此，采用針對這兩大信號通路的干預很可能可以抑制或延緩心肌纖維化進程;但由于這些信號分子往往具有多種功能，針對它們的干預在實際操作時需要慎重考慮，以免引起不良后果。

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