Livin和Smac在大腸癌組織中的表達及相關(guān)性分析

彭淑梅 嚴(yán) 紅 羅 欣 (井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床系實驗室，江西 吉安 343000)

Livin和Smac在大腸癌組織中的表達及相關(guān)性分析

彭淑梅 嚴(yán) 紅 羅 欣1(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床系實驗室，江西 吉安 343000)

目的 檢測Livin和Smac在人大腸癌組織中的表達并分析其臨床意義。方法 收集42例大腸癌組織和22例正常大腸組織，用免疫組織化學(xué)方法和RT－PCR檢測Livin和Smac的蛋白及mRNA表達情況。結(jié)果 大腸癌組織中Livin的表達率高于正常大腸組織(P＜0.001)，Smac的表達率則低于正常大腸組織(P＜0.001)，Livin與Smac的表達呈負相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論 Livin和Smac可能是大腸癌細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)。

Livin;Smac;大腸癌;凋亡

近年來，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡成為大腸癌防治的熱點之一。Livin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)的成員之一，對抑制細胞凋亡起著重要作用〔1〕。Smac是新近發(fā)現(xiàn)的直接抑制IAPs的蛋白，能夠與Livin結(jié)合成Smac－Livin復(fù)合物，解除Livin的抑制作用，發(fā)揮促凋亡作用〔2〕。本研究檢測大腸癌組織和正常大腸組織中Livin和Smac的蛋白及mRNA表達，旨在探討兩者在大腸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年3月至2010年10月井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)切除的大腸癌標(biāo)本42例，其中男22例，女20例，年齡30～79歲，中位年齡56.5歲。按Dukes分期分類:A期7例，B期15例，C期15例，D期5例。患者術(shù)前均未采用放療、化療或針對腫瘤的其他治療，術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)診斷證實。22例正常對照標(biāo)本取自經(jīng)病理證實無腫瘤殘留的結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本的切緣。

1.2 方法

1.2.1 Livin蛋白和Smac蛋白的檢測 手術(shù)標(biāo)本用10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，閱片證實為結(jié)直腸腺癌或正常組織。另取切片行免疫組織化學(xué)染色，采用PV－9000二步法，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。免抗人Livin多克隆抗體為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，濃度為1∶50。兔抗人Smac多克隆抗體為Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品，濃度為1∶200。PV－9000購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 蛋白檢測結(jié)果判斷 Livin和Smac陽性染色為棕黃色顆粒，主要在胞質(zhì)中表達。每張切片在10×40倍光鏡下隨機觀察5個視野，計算陽性細胞數(shù)。分級方法如下:染色強度，不著色為0，輕度著色為1，中度著色為2，強著色為3;陽性細胞所占百分比:無著色比為0，＜10%為1，10% ～50%為2，＞50%為3。兩種積分相加，依照0為(－)、1～2為(+)、3～4為()、5～6為()，進行半定量判斷:(－)為陰性、(+)為弱陽性、()為陽性、()為強陽性，進行統(tǒng)計學(xué)分析時(+～)皆為陽性。

1.2.3 Livin mRNA和Smac mRNA的檢測 手術(shù)標(biāo)本離體后立即放入高壓滅菌后的凍存管中，液氮凍存，盡快提取RNA。RT－PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，通過Band Scan圖像分析軟件讀取目的電泳條帶的灰度值，以β－actin條帶的灰度值標(biāo)化其相應(yīng)的 Livin α、Livin β和 Smac表達量。用 Primer5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工生物技術(shù)公司合成。Livin的上游引物為 5′CGCACGGCACAAAGACGA 3′，下游引物為 5′GTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA 3′，Livin α 與 Livin β 的產(chǎn)物長度分別為351 bp和297 bp。內(nèi)參照 β－actin的上游引物為 5′AGCCATGTACGTAGCCATCC 3′，下游引物為 5′CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA 3′，擴增片段為228 bp。Livin和β－actin反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，然后 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min 擴增 32 個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。Smac的上游引物為5′GTGCGGTTCCTATTGC 3′，下游引物為 5′GATTCCTGGCGGTTAT 3′，擴增片段為393 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 30 s、43℃ 30 s、72℃ 1 min擴增32個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。計量資料采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 兩組中Livin蛋白和Smac蛋白表達情況的比較 大腸癌組織中Livin蛋白陽性表達率為66.7%(28/42)，而正常大腸組織僅為13.6%(3/22)，大腸癌組織明顯高于正常大腸組織(χ2=16.256，P＜0.001)。Smac蛋白在大腸癌組織中的陽性表達率為42.9%(18/42)，正常大腸組織陽性表達率為72.7%(16/22)，高于大腸癌組織(χ2=5.173，P ＜0.05)。

2.2 兩組中Livin mRNA和Smac mRNA表達情況的比較

Livin α mRNA和Livin β mRNA在大腸癌組織中的表達明顯高于正常大腸組織(P＜0.001)，而Smac mRNA在大腸癌組織中的表達明顯低于正常大腸組織(P＜0.001)。見表1。

表1 兩組Livin、Smac mRNA表達情況的比較(±s)

表1 兩組Livin、Smac mRNA表達情況的比較(±s)

組別 n Livin α mRNA Livin βmRNA Smac mRNA大腸癌組42 0.597±0.100 0.578±0.090 0.105±0.055正常組 22 0.123±0.083 0.127±0.070 0.563±0.067 F值 0.388 0.885 1.362 P值0.000 0.000 0.000

2.3 大腸癌組織中Livin與Smac表達的相關(guān)性分析 大腸癌組織中Livin蛋白與Smac蛋白共陽性表達15例，共陰性表達11例，僅Livin陽性13例，僅Smac陽性13例，二者表達呈負相關(guān)(r= －0.387，P ＜0.05)。并且，大腸癌組織中 Livin α、Livin β mRNA與 Smac mRNA表達也呈負相關(guān)(r=－0.493，P ＜0.05;r= －0.476，P ＜0.05)。

3 討論

IAPs家族是一類獨立于Bcl－2的抗凋亡蛋白，均含有IAP同源序列(BIR)和RING指結(jié)構(gòu)域，能夠抑制細胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系〔3〕。Livin又稱腎IAP(KIAP)，是新近發(fā)現(xiàn)的人類IAPs家族成員〔4〕，基因位于X染色體20q13.3，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物因剪切方式不同有兩種 mRNA亞型:Livin α和Livin β，分別編碼298和280個氨基酸的蛋白質(zhì)，兩者除相差一段54 bp以外，其他完全一致〔5〕。Smac是目前發(fā)現(xiàn)的唯一存在于哺乳動物細胞中直接抑制IAPs的蛋白，在正常組織中分布較廣泛〔6〕。其前體存在于正常細胞線粒體中，在凋亡信號刺激下釋放至細胞質(zhì)，經(jīng)修飾形成成熟的Smac。Smac可直接與Livin結(jié)合成Smac－Livin復(fù)合物，與半胱氨酸蛋白酶(caspase)競爭結(jié)合BIR結(jié)構(gòu)，使Livin的BIR功能區(qū)失去活性，解除Livin的抑制作用，從而釋放活化的caspase而下調(diào)其抗凋亡活性〔7〕。

目前，Livin和Smac在大腸癌的表達及相互關(guān)系國內(nèi)外研究很少。國外研究顯示，Livin在很多人類惡性腫瘤中高表達，如黑色素瘤、膀胱癌、胰腺癌細胞系及結(jié)腸癌細胞系、非小細胞肺癌、前列腺癌細胞〔8〕。本研究結(jié)果顯示正常大腸組織中Smac表達顯著高于大腸癌組織，而大腸癌組織中Livin的表達顯著高于正常大腸組織，不僅從蛋白表達水平，還從mRNA表達水平證實了這一點。因此，預(yù)示Livin可作為一種新的腫瘤抗原來檢測胃腸道腫瘤，Livin有希望成為大腸癌發(fā)生早期階段的分子標(biāo)記物和診斷指標(biāo)。

Spearman等級相關(guān)分析顯示大腸癌組織中Livin蛋白與Smac蛋白表達呈負相關(guān)。Pearson相關(guān)分析從mRNA表達水平也證實了兩者的負相關(guān)性。這提示Livin和Smac的表達可能存在負反饋調(diào)節(jié)或者相互拮抗關(guān)系，可以推測Smac通過與Livin結(jié)合而抑制后者的抗凋亡活性，發(fā)揮促凋亡作用。是否還存在其他途徑發(fā)揮拮抗作用有待進一步的研究。現(xiàn)已有研究證明將Smac cDNA轉(zhuǎn)染腎細胞癌細胞能提高其對促凋亡刺激的敏感性〔9〕，因而Smac對腫瘤的治療有重要作用。

Livin和Smac的表達關(guān)系可能是大腸癌細胞凋亡信號傳導(dǎo)通路中的重要環(huán)節(jié)。對Livin和Smac在大腸癌中相互關(guān)系的研究將有助于尋找IAP抑制劑，從而將促進腫瘤細胞凋亡發(fā)展為腫瘤治療的新靶點。

1 Vucic D，Stennicke HR，Pisabarro MT，et al.ML－IAP，a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas〔J〕.Curr Biol，2000;10(21):1359－66.

2 Du C，F(xiàn)ang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c－dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition〔J〕.Cell，2000;102(1):33－4.

3 Crook NE，Clem RJ，Miller LK.An apoptosis－inhibiting baculovirus gene with a zinc finger－like motif〔J〕.J Virol，1993;67(4):2168－74.

4 Lin JH，Deng G，Huang Q，et al.KIAP，a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;279(3):820－31.

5 Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern〔J〕.FEBS Lett，2001;495(1－2):56－60.

6 Chai J，Du C，Wu J，et al.Structural and biochemical basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO〔J〕.Nature，2000;406(6798):855－62.

7 Vucic D，Deshayes K，Ackerly H，et al.SMAC negatively regulates the anti－apoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(ML－IAP)〔J〕.J Biol Chem，2002;277(14):12275－9.

8 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis portein familly member〔J〕.J Biol Chem，2001;276(5):3238－46.

9 Mizutani Y，Nakanishi H，Yamamoto K，et al.Downregulation of Smac/DIABLO expression in renal cell carcinoma and its prognostic significance〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(3):448－54.

R735.3

A

1005-9202(2011)12-2190-02

2010年江西省教育廳科技計劃項目青年項目(GJJ10204)

1 吉安市第三人民醫(yī)院

彭淑梅(1970－)，女，實驗師，主要從事臨床實驗工作。

〔2011－02－11 收稿 2011－04－22 修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)