聚乙二醇修飾多壁碳納米管對質粒DNA的影響

勞文艷， 商迎輝， 焦 正， 勞鳳學

(1.北京聯合大學北苑校區，北京100012;2.上海大學環境與化學工程學院，上海200444)

隨著納米技術的發展，碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)的用途越來越廣［1-6］，與科研人員和普通大眾的接觸也越來越多.因此，在CNTs基材料廣泛應用之前，深入徹底地研究其健康與安全問題非常有必要.CNTs或含CNTs復合材料的生物相容性研究已經成為CNTs研究領域的一個新熱點.Webster等［7］研究了一系列復合材料 polyurethane (PU)/CNTs和星狀細胞的關系，并發現隨著CNTs含量的提高，材料中的星狀細胞量減少，并且阻礙了星狀細胞的增殖.Hu等［8］和Gabay等［9］的研究結果顯示，經聚乙烯亞胺化學修飾后的CNTs對神經細胞生長有促進作用.Supronowicz等［10］發現，導電復合材料polylactic acid(PLA)/MWNTs通過交流電擊能夠明顯提高造骨細胞的增殖速度.

DNA是生物體中一類最基本的大分子，是遺傳信息的原初載體，是細胞生長、發育、繁殖和遺傳的重要物質基礎.研究由納米材料所導致的DNA結構和功能的變化，有利于從微觀角度理解納米材料的生物相容性本質，從而為探討和解決宏觀領域中的實際問題提供依據.本研究通過電泳實驗和原子力顯微鏡觀測，分析多壁碳納米管(MWNTs)和PEG修飾MWNTs與質粒DNA的作用情況，并從二者對質粒DNA損傷的角度考察了MWNTs的生物相容性.

1 實驗

本實驗中使用的MWNTs直徑為10～30 nm，長度為5～50 μm，購自深圳市納米港公司.本實驗采用混酸氧化法純化MWNTs，用V(濃硝酸)∶V(濃硫酸)=1∶3的混合酸超聲處理MWNTs，通過離心分離和真空干燥，得到的黑色固體為純化MWNTs.PEG修飾MWNTs的合成方法為如下：取干燥的50 mg純化MWNTs，加入15 mL pH=7.0的磷酸鹽緩沖液中，超聲分散均勻，加入 200 mg的碳二亞胺與250 mg N-羥基琥珀酰亞胺，超聲30 min，再加入500 mg PEG-1500，置于磁力攪拌器上室溫攪拌24 h，反應后的溶液用水洗滌，12 000 r/min離心分離30 min，得到的固體用去離子水洗滌后再用0.22 μm的纖維素微孔濾膜真空過濾，得到PEG修飾MWNTs.原始MWNTs、純化MWNTs和PEG修飾MWNTs的透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)照片如圖1所示.

本實驗中所使用的其他試劑均為分析純.實驗采用堿法抽提質粒DNA，所用質粒為pGBKT7，大小約為7.3 kb.MWNTs經超聲振蕩后與DNA混合形成混合溶液，然后進行凝膠電泳實驗.取9 μL樣品加入1 μL的loading buffer(染色劑)混合均勻，按照由高到低的濃度順序，用移液槍依次在每個孔中注入樣品、質粒和loading buffer的混合物，最后加入水、質粒和loading buffer的混合物作為對照.電泳實驗電壓設定為120 V，時間設定為50 min.

使用天能凝膠成像系統對電泳結果進行凝膠成像，應用凝膠成像系統的分析軟件對凝膠中不同形態DNA的光密度進行定量分析，從而得到不同質量濃度下MWNTs對質粒DNA的損傷情況.

使用島津公司的SPM-9600AFM觀察MWNTs對DNA的作用.對質粒DNA進行成像時，AFM采用如下的制樣方法.在室溫下，將250 μg/mL的原始WMNTs、純化WMNTs和PEG修飾MWNTs與DNA溶液混合(質粒DNA終質量濃度控制在250 ng/mL左右)，渦旋震蕩器上恒溫(25℃)輕輕震蕩24 h.用移液槍吸取5 mL的MWNTs與質粒DNA的混合液，緩緩滴于3-氨基丙基三乙氧基硅烷-云母襯底上，隨后用干凈平整的封口膜輕輕覆蓋在液滴上，并使溶液均勻地平鋪在襯底上.將襯底靜置幾分鐘后揭去封口膜，吸取少量的去離子重蒸水沖洗襯底面，重復沖洗若干次以便去除未吸附的質粒.最后，將沖洗后的襯底置于陰涼干燥處，使殘留在襯底上的水分自然風干，樣品制備完畢.由于是測試生物樣品，掃描速率要盡量放慢在0.5 Hz左右，振源幅度要盡量調低，設置點調高，確保在成像時，AFM的針尖以較小的力拍擊樣品表面，從而不會對樣品產生破壞.

2 結果與討論

2.1 電泳實驗結果與討論

圖1 MWNTs的TEM圖Fig.1 TEM images of MWNTs

本實驗選擇體外評價方法(plasmid DNA assay)對MWNTs以及PEG修飾MWNTs的生物活性進行研究.在納米材料對DNA的損傷過程中，最初的損傷表現為超螺旋DNA松弛(relaxed)，進一步的損傷表現為DNA的線化(linearized).正常的質粒DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度比松弛和線化的DNA快，故在智能凝膠成像系統所生成的圖像中能夠得到3條明顯分開的條帶(見圖2).通過對圖2進行分析，可以定量檢測不同的納米材料對質粒DNA超螺旋部分的損傷程度［11］，并由此對納米材料的生物相容性作出相應的評價.

圖2 不同質量濃度的MWNTs對質粒DNA損傷的凝膠成像結果(μg/mL)Fig.2 Gel images of plasmid DNA damage by various concentration of MWNTs(μg/mL)

圖3為不同質量濃度的CNTs對質粒DNA損傷情況的定量分析結果.可以看出，當原始單壁碳納米管 (single-walled CNTs，SWCNTs)質量濃度為125 μg/mL時便開始損傷質粒DNA，并且隨著質量濃度的增加，損傷程度也逐漸增加;當質量濃度達到2 000 μg/mL時，對質粒DNA的損傷已非常明顯，可達48.6%.純化MWNTs對質粒DNA的損傷較原始SWCNTs稍有減弱，低質量濃度范圍內的純化MWNTs對質粒DNA超螺旋部分的損傷百分比處于一個較低的水平;但當質量濃度達到2 000 μg/mL時，純化MWNTs對質粒DNA超螺旋部分的損傷也達到了21.1%，表明原始SWCNTs和純化MWNTs在達到一定質量濃度時，對質粒DNA都有較為明顯的損傷.而PEG修飾MWNTs對質粒DNA的損傷明顯減弱，其損傷百分比一直處于一個非常低的水平;當質量濃度達到2 000 μg/mL時，PEG修飾MWNTs對質粒DNA超螺旋部分的損傷也只有13.6%.

2.2 AFM實驗結果與討論

AFM在生物結構的研究中具有如下獨特的優勢：①可在納米水平上分辨生物大分子的結構信息;②具有直觀的三維表面信息;③樣品制備相對簡單，無需進行染色、包埋等復雜處理過程;④可深入了解單個生物分子的三維結構變化.越來越多的研究者利用AFM來研究DNA的結構變化.Pang等［12］利用AFM研究了電子輻射導致水溶液中DNA斷裂的情況.Zhu等利用AFM觀測了Zn2+導致DNA扭曲的現象.本實驗利用 AFM分別觀測了純pGBKT7質粒結構以及原始MWNTs、純化MWNTs和PEG修飾MWNTs對質粒DNA結構的影響，結果如圖4～圖7所示.

圖3 不同質量濃度的CNTs溶液中質粒DNA超螺旋部分的損傷情況Fig.3 Percentage of supercoiled DNA damage in CNTs solution at different mass concentration

圖4為純pGBKT7質粒DNA的AFM圖像，可以清晰地看到，其完整的環狀結構均勻地分布在云母片上，每個環狀質粒的外徑約為85 nm，高度約為2 nm.

圖4 pGBKT7質粒DNA的AFM圖像Fig.4 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA

圖5為質粒DNA與原始MWNTs混合培養后的AFM圖像.可以看出，未經純化的原始MWNTs對質粒DNA的損傷非常嚴重，絕大多數質粒DNA失去了其完整的環狀結構，即共價閉合環狀質粒DNA發生鏈斷裂變成了開環的質粒(open circular DNA，ocDNA)，還有一些質粒DNA發生了更為嚴重的斷裂現象，即斷裂成小段并形成線化 DNA(linear DNA，lDNA).

圖5 pGBKT7質粒DNA與原始MWNTs混合培養后的AFM圖像Fig.5 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with pristine MWNTs

圖6為質粒DNA與純化MWNTs混合培養后的AFM圖像.可以看出，大部分質粒DNA保持了原有的完整環狀結構，在與原始MWNTs共同培養過程中出現的共價閉合環斷裂現象已經得到了明顯的改善，線化的質粒DNA較少，但質粒DNA出現了扭曲現象，DNA間的糾結、纏繞現象也較為嚴重.由圖6可以明顯地看到，質粒DNA在云母片上的分布不均勻，大量的質粒DNA團聚成一簇.

圖6 pGBKT7質粒DNA與純化MWNTs混合培養后的AFM圖像Fig.6 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with purified MWNTs

圖7為質粒DNA與PEG修飾MWNTs混合培養后的AFM圖像.可以明顯地看出，大部分的質粒DNA完整地保存了其環狀結構，基本上未出現開環、線化和團聚的現象，絕大多數環狀質粒DNA均勻地分布在云母片上.AFM圖像中出現的管狀結構為PEG修飾MWNTs，點狀結構為質粒DNA，它們均勻地分布在云母片上，結構非常完整.

圖7 pGBKT7質粒DNA與PEG修飾MWNTs混合培養后的AFM圖像Fig.7 AFM images of pGBKT7 plasmid DNA after incubated with PEG-MWNTs

通過AFM的剖面分析觀測，可以發現與各種MWNTs混合培養之后，質粒DNA的外徑都有不同程度的收縮，純的質粒DNA的直徑為80～90 nm，平均直徑約為85 nm.純化MWNTs與質粒DNA共同培養后，質粒DNA的收縮情況比較明顯，平均直徑收縮至50 nm左右.PEG修飾MWNTs與質粒DNA共同培養后，質粒DNA的收縮情況不明顯，平均直徑在75 nm左右.利用AFM中的長度分析軟件，對每種外徑的縮小情況統計40個質粒DNA，結果如表1所示.

表1 pGBKT7質粒DNA與純化后的MWNTs，PEG修飾WMNTs混合培養后外徑測量Table 1 Outer mean diameters for ringlike plasmid DNA incubated with purified-MWNTs and PEG-MWNTs measured by AFM

AFM觀測得到的結果與電泳實驗所得到的結論非常吻合.未經純化處理的原始MWNTs對質粒DNA的損傷較為嚴重，原因可能是原始MWNTs中含有的包括鐵、鈷、鎳等金屬顆粒雜質對質粒DNA產生了損傷.經過純化的MWNTs，由于金屬催化劑和大部分的雜質顆粒被除去，因而對質粒DNA的損傷有所減弱，不會造成質粒DNA的斷裂，但質粒DNA發生了收縮和扭曲現象.經過 PEG修飾的MWNTs，由于其表面包裹了一層溶解性良好的高分子材料，體現出較好的生物相容性.其對質粒DNA的損傷非常小，不會造成質粒DNA的斷裂和扭曲，基本完好地保持了原有的形態.

3 結束語

Plasmid DNA assay的研究結果表明，就對質粒DNA的損傷程度而言，原始MWNTs＞純化MWNTs＞PEG修飾MWNTs.PEG修飾MWNTs具有較好的生物相容性，當質量濃度達到2 000 μg/mL時，PEG修飾MWNTs對質粒DNA超螺旋部分的損傷也只有13.6%;而在相同質量濃度下，原始MWNTs和純化MWNTs對質粒 DNA超螺旋部分的損傷分別為48.6%和21.1%.

AFM觀察的結果和plasmid DNA assay的結果非常吻合.原始MWNTs能夠造成大量的質粒DNA分解、斷裂成線狀.純化MWNTs對質粒DNA的形貌損傷有所減弱，大部分質粒DNA保持了原有的環狀結構，但質粒DNA的收縮、團聚和纏繞現象非常明顯.PEG修飾MWNTs對質粒DNA形貌的影響最弱，絕大多數質粒DNA完好地保持了原有的環狀結構，質粒的收縮現象不明顯.

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