P311蛋白與金屬硫蛋白ⅡA相互作用位點的計算機預測

薛曉怡， 馮鐵男， 王群群， 王翼飛

(上海大學理學院，上海200444)

P311是一種具有重要生物學作用的細胞因子，它參與體內(nèi)細胞分化、調(diào)節(jié)其他蛋白/基因轉(zhuǎn)錄、創(chuàng)傷修復、腫瘤發(fā)生等多種正常或異常的生物學活動［1-2］.已有的研究結(jié)果顯示，P311在抗纖維化、瘢痕形成、促進神經(jīng)細胞再生以及組織損傷修復等方面有著非常重要的作用［3-4］.

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸、無芳香族氨基酸、能與金屬結(jié)合且普遍存在于生物界的非常獨特的蛋白質(zhì)［5］.哺乳動物組織中通常含有4個較大的MT組分：MT-1，MT-2，MT-3和MT-4.這些組分又可分為10個有生物學功能的亞型和7個無生物學功能的亞型［6］，其中MT2A是MT-2組分中唯一具有生物學功能的蛋白質(zhì)［7］.研究表明，MT2A不僅具有重金屬解毒、清除自由基、抗輻射、修復組織損傷、抗衰老以及調(diào)節(jié)微量元素平衡等重要作用，還與細胞的增殖、凋亡，多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及腫瘤耐藥性密切相關(guān)［8-10］.

Miura等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，MT2A參與P311基因的表達，其主要表現(xiàn)在缺乏MT2A的轉(zhuǎn)基因小鼠中存在P311表達的缺失，這說明MT2A在P311的表達中可能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，表明二者存在相互作用的關(guān)系.本研究采用同源建模的方法構(gòu)建P311蛋白的3D結(jié)構(gòu)，通過計算機模擬蛋白質(zhì)間的相互作用，預測二者間的作用區(qū)域及作用位點，找出關(guān)鍵殘基，為進一步的實驗研究奠定了一定的基礎(chǔ).

1 材料與方法

本研究的P311蛋白序列(編號為NP_001135955)由NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取.在Brookheaven Protein Databank(PDB)數(shù)據(jù)庫中，人體MT2A沒有完整的單體，只有被蛋白酶降解后單一的α或β結(jié)構(gòu)域.本研究選取人體MT2A的α結(jié)構(gòu)域作為研究對象(PDB代碼為1MHU)，使用的軟件包主要有SYBYL 8.0，Autodock 4.0和Chimera.

1.1 P311蛋白3D結(jié)構(gòu)模建

1.1.1 同源建模步驟

P311蛋白3D模建、能量優(yōu)化和計算均采用SYBYL 8.0軟件包完成，除特別說明之外，計算中選用的參數(shù)均為默認值.

輸入需要模建的P311蛋白序列，在SYBYL 8.0的HOMSTRAD數(shù)據(jù)庫中尋找同源蛋白，選取P311蛋白可同源建模的最優(yōu)模板;同源蛋白結(jié)構(gòu)疊合以確定SCR區(qū)和Loop區(qū);通過序列對比確定參考蛋白與目標蛋白之間的序列保守區(qū);復制序列保守區(qū)中參考蛋白的坐標給目標序列;確定目標序列中其他區(qū)域的結(jié)構(gòu)，包括C端和N端的結(jié)構(gòu)以及Loop區(qū)或柔性區(qū)域的結(jié)構(gòu);確定目標蛋白殘基側(cè)鏈的坐標;利用分子動力學對搭建的模型進行側(cè)鏈位置的修正優(yōu)化;評估模建蛋白在結(jié)構(gòu)和折疊模式上是否合理［12］.

1.1.2 能量優(yōu)化

使用SYBYL 8.0中的Biopolymer模塊對得到的模建蛋白加全氫，加Kollman_all電荷，采用Tripos力場，電解質(zhì)常數(shù)為1.0.能量優(yōu)化采用逐步放開的策略，先對蛋白的氫原子進行能量優(yōu)化，進而優(yōu)化側(cè)鏈、主鏈直至全部放開優(yōu)化.優(yōu)化過程采用Ramachandran圖和ProTable檢驗蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)合理性，得到最終的3D結(jié)構(gòu)模型.

1.2 P311與MT2A分子對接

從PDB數(shù)據(jù)庫直接獲取的結(jié)構(gòu)存在一定的不合理碰撞和張力，因此，配體分子MT2A用于研究前，要先在SYBYL 8.0中進行簡單的分子力學能量優(yōu)化.在Tripos力場下，以Gasteiger方法計算電荷，進行能量優(yōu)化，迭代次數(shù)為1 000次，收斂梯度為4.186 8 kJ/(mol·nm).

在實施計算機對接前，首先，對配體與受體進行坐標規(guī)范化，使二者處于相同的坐標系下.隨后，利用Autodock 4.0將P311結(jié)構(gòu)模型與經(jīng)過預處理的配體分子MT2A進行分子對接：① 先生成參數(shù)文件，根據(jù)SiteID找到可能的活性位點為口袋，口袋周圍選取幾個殘基;②以這些殘基的中心為格點盒子的中心，產(chǎn)生一個格點間距為0.037 5 nm，x，y，z 3個方向分別為80×96×78格點的盒子;③ 使用Autogrid 4.0產(chǎn)生grid文件，該文件中包括探針原子在各個網(wǎng)格點與受體的相互作用能;④ Autodock 4.0運用Lamarchian遺傳算法，將局部能量搜索與遺傳算法相結(jié)合，以半經(jīng)驗函數(shù)作為能量打分函數(shù)，對MT2A構(gòu)象和位置進行全局搜索，對MT2A與模建結(jié)構(gòu)進行獨立的10次對接實驗，選取結(jié)合能最低的構(gòu)象作為最佳對接構(gòu)象.最后，將所選結(jié)果生成的分子從輸出文件中提取，并與受體文件合并，形成一個復合物的結(jié)構(gòu).

P311蛋白同源建模以及與MT2A分子對接的流程如圖1所示，具體步驟如下：①從PDB數(shù)據(jù)庫下載配體MT2A的3D結(jié)構(gòu)，PDB代碼為1MHU，從基因數(shù)據(jù)庫NCBI中獲取P311蛋白序列，在SYBYL 8.0中進行同源建模，能量優(yōu)化，最終得到P311蛋白的結(jié)構(gòu)模型;② 將受體P311蛋白與配體MT2A導入Autodock 4.0中進行分子對接;③從10個對接構(gòu)象中，選取結(jié)合能最低的構(gòu)象為最佳對接構(gòu)象;④從Autodock 4.0的輸出文件中提取最佳對接構(gòu)象與受體P311蛋白的PDB文件合并，形成復合物構(gòu)象;⑤分析受體P311蛋白與配體MT2A的復合物結(jié)構(gòu)，找出關(guān)鍵殘基.

圖1 P311蛋白同源建模以及與MT2A分子對接流程圖Fig.1 Flow chart of P311 protein’s homology modeling and docking with MT2A

2 結(jié)果與討論

2.1 序列聯(lián)配及同源建模結(jié)果

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取人的P311蛋白序列，其中包含68個氨基酸殘基.在SYBYL 8.0的HOMSTRAD數(shù)據(jù)庫中尋找同源蛋白，得到10個候選模板，前3位的模板為 hs1i5kd，hs2dohc和 hs2i32e，三者與P311蛋白序列的比對如圖2所示.得分最高的模板hs1i5kd為A族鏈球菌表面蛋白M蛋白，PDB數(shù)據(jù)庫中1I5K的 D鏈與P311蛋白序列的同源性為30.8%，滿足了進行同源建模最低同源性25%～30%的要求.因此，本研究選取得分最高、同源性較好的模板hs1i5kd作為P311蛋白同源建模的最優(yōu)模板，最后得到的3D結(jié)構(gòu)模型如圖3所示.

圖2 P311蛋白與hs1i5kd，hs2dohc和hs2i32e的序列比對Fig.2 Comparison of sequence alignments between P311 protein and hs1i5kd，hs2dohc and hs2i32e

圖3 P311蛋白3D結(jié)構(gòu)Fig.3 P311 protein 3D structure

同時，在SYBYL 8.0中對P311蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預測(見圖4).結(jié)果表明，P311蛋白是由多個α螺旋和少數(shù)β折疊構(gòu)成，與模建結(jié)構(gòu)(見圖3)基本相符，增加了模建結(jié)構(gòu)的可信度.

圖4 P311蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Fig.4 Prediction of P311 protein’s secondary structure

采用 ProTable分析蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的Ramachandran圖(見圖5).可以看出，模建結(jié)構(gòu)蛋白的主鏈結(jié)構(gòu)基本合理，主鏈二面角φ和ψ落于中心區(qū)域和“可接受區(qū)域”的殘基占91.2%，絕大多數(shù)的φ和ψ角均在正常范圍內(nèi)，沒有落在不允許區(qū)域內(nèi)的殘基.

圖5 P311蛋白模建結(jié)構(gòu)Ramachandran圖Fig.5 Ramachandran plot of the modeled structure of P311 protein

利用Biopolymer/SiteID分析P311蛋白的活性位點，發(fā)現(xiàn)在模建結(jié)構(gòu)中有2個空腔(見圖6)，其溶劑化氛圍、空腔體積以及作為可能的活性位點的氨基酸殘基如表1所示.這些殘基為進行分子對接時選取適當?shù)臍埢鳛榛钚钥诖峁┝擞欣麉⒖?

圖6 SiteID發(fā)現(xiàn)的P311活性位點Fig.6 Active site of P311 protein discovered by SiteID

表1 P311蛋白的2個空腔中可能的活性位點Table 1 Two cavities discovered on the modeled structure of P311 protein

2.2 P311蛋白與配體MT2A的對接

采用Autodock 4.0評價模建的合理性，并預測P311蛋白與配體MT2A(見圖7)的對接情況.該軟件能夠自動將底物對接到受體的活性中心或結(jié)合部位，并利用遺傳算法尋找合適的結(jié)合構(gòu)象，使得配體與受體的形狀和相互作用的匹配效果達到最佳穩(wěn)定狀態(tài)，形成合理的復合物結(jié)構(gòu).

經(jīng)Autodock 4.0分子對接后得到了10個對接構(gòu)象，其結(jié)合能排序結(jié)果如表2所示.從最低結(jié)合能考慮，選取表格中第一個配體(編號為6)作為最優(yōu)可能對接形式.將該配體中生成的配體分子從輸出文件中提取并與受體文件合并，形成了一個復合物結(jié)構(gòu).利用SYBYL 8.0軟件生成的復合物結(jié)構(gòu)模型如圖8所示，氫鍵連接如圖9所示.圖8中的深色部分為計算機預測出的二者相互作用區(qū)域，淺色部分為附近的相關(guān)區(qū)域.圖9中的配體MT2A以球棍型表示，受體P311蛋白以棍型表示，黑色代表與配體相互作用的殘基，淺灰色代表附近的相關(guān)殘基，深灰色表示較遠殘基.

圖7 配體MT2A 3D結(jié)構(gòu)Fig.7 MT2A 3D structure

表2 10個對接構(gòu)象的結(jié)合能Table 2 Binding energy of the ten conformations

圖8 P311蛋白表面化后的復合物結(jié)構(gòu)Fig.8 Complex structure after surfacing P311 protein

圖9 P311蛋白與MT2A氫鍵作用示意圖Fig.9 Hydrogen bond interactions between P311 protein and MT2A

從圖8可以看出，配體MT2A嵌于受體P311蛋白的活性口袋中，形成了穩(wěn)定的復合物結(jié)構(gòu).從圖9 (a)中看到，配體殘基 LYS31的末端與受體殘基GLU14和TRP10相互吸引，LYS31殘基與GLU14殘基有氫鍵連接，形成了穩(wěn)定結(jié)構(gòu).在圖9(b)中，配體殘基ALA61伸入到受體SER48，PRO51及LEU52所形成的活性口袋中，并與上述三者的分子表面形成幾何互補，其中殘基ALA61與SER48之間有氫鍵作用，形成了穩(wěn)定結(jié)構(gòu).在圖9(c)中，配體殘基LYS43與受體殘基GLU56相互靠近，也形成了穩(wěn)定的氫鍵結(jié)構(gòu)，這些氫鍵對促進和穩(wěn)定底物MT2A結(jié)合到P311蛋白的活性中心起到了重要的作用.

通過上述表象，受體殘基GLU14，SER48以及GLU56成為重要功能殘基的可能性很高，該可能性有待實驗的進一步驗證.

3 結(jié)束語

P311蛋白具有多種生物學功能，除了促神經(jīng)再生、創(chuàng)傷修復、腫瘤浸潤等方面外，在其他的一些疾病中依然見有表達并可能參與其中.設計與P311特異性結(jié)合的小分子藥物，或者通過影響P311的某些關(guān)鍵殘基的活性來抑制或促進它的生物學功能，將成為研究的焦點.

本研究采用同源建模的方法模建了P311蛋白的3D結(jié)構(gòu)，使用ProTable分析和Ramachandran圖驗證其合理性.結(jié)果表明，大部分氨基酸的φ和ψ角分布在合理的區(qū)域.通過預測P311蛋白的二級結(jié)構(gòu)可知，P311蛋白由多個α螺旋構(gòu)成，與模建結(jié)構(gòu)基本相符.經(jīng)配體MT2A與受體P311蛋白的模建結(jié)構(gòu)分子對接后，發(fā)現(xiàn)受體殘基GLU14，SER48以及GLU56可能是重要的功能殘基.這些研究結(jié)果為進一步了解P311蛋白的作用域、反應機制以及功能等提供了新的視角和重要信息，使生物學實驗研究更有目的性、方向性及針對性，大大降低了研究成本，為發(fā)現(xiàn)藥靶及研制新的藥物提供了強有力的工具.

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