Cupriavidus necator JMP134細菌人工染色體基因組文庫的構建與鑒定

張俊亞， 宋任濤， 許政暟， 朱晨光

(上海大學生命科學學院上海市能源作物育種及應用重點實驗室，上海200444)

Cupriavidus necator JMP134(C.necator JMP134)又名Alcaligenes eutrophus，Ralstonia eutropha，Wautersia eutropha，最初因其能在含有2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的培養基上生長而從土壤中被分離出來.C. necator JMP134是一株典型的能夠降解氯代芳香族化合物的菌株，它可以分解2，4-D、鹵代苯甲酸、氯酚和硝基苯酚，并可以60多種芳香族化合物作為唯一碳源生長，在環境污染治理上具有很好的應用潛力［1］.

C.necator JMP134菌株的基因組已在2005年由美國聯合基因組研究所(JGI)完成測序，其大小為7.25 Mb，由2條染色體以及2個大小分別為635和88 kb的大質粒構成，其中與芳香化合物降解功能相關的基因6 616個，包括了12種主要芳香化合物降解途徑中的11種，共編碼了70多種降解芳香化合物所需的加氧酶［1］.

通過比較基因組分析可以發現，C.necator JMP134有2套苯酚降解基因簇，其中長簇大小約為23 kb，短簇約為8 kb.目前關于苯酚降解基因的研究大多是基于其基因簇中單個基因的功能展開的［2-4］，在整個基因簇的表達水平上對其進行功能分析的研究尚未見報道.另外，有關2套苯酚降解基因簇在宿主細菌中的協同作用機制的研究，也尚未見有任何報道.因此，以C.necator JMP134菌株為模式材料，對其2套苯酚降解基因簇進行深入的功能分析，將為創造更高效的苯酚降解工程菌提供有效的備選基因和研究方案，具有重要的理論研究意義和實際應用前景.

由于完整的苯酚降解基因簇長度通常在20 kb以上，欲克隆此類基因簇用于表達分析，構建基因組大片段文庫必不可少.細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)載體的復制子來源于單拷貝質粒F因子，與其他基因組DNA大插入片段文庫相比，BAC文庫除了插入片段較大外，還具有遺傳穩定性好、嵌合現象低等優點［5-6］.此外，BAC載體以大腸桿菌為宿主，電擊轉化效率較高，常規方法(堿裂解)即可分離重組BAC質粒，藍白斑和菌落原位雜交等技術均可用于目的基因的篩選，而且可對克隆在BAC的插入DNA直接測序.目前，BAC已成為應用最廣泛的構建大插入片段基因組文庫的載體系統.

本研究以 pIndigo-BAC 5為載體，構建了 C.necator JMP134菌株的BAC基因組文庫.為了能夠迅速、準確地篩選獲得目的基因，通過篩選該菌株的2號基因簇苯酚羥化酶大亞基基因phlN2，驗證了篩選方法的有效性以及所建文庫的覆蓋率.該BAC文庫的構建以及篩選體系的建立，為克隆降酚基因簇及對其進行酶催化功能分析創造了有利條件.

1 材料和方法

1.1 材料

C.necator JMP134菌株購自德國菌種與細胞保藏中心(DSMZ)，菌株號為 DSM 4058;BAC載體pIndigo-BAC 5(HindⅢ)購自Epicentre公司;低熔點瓊脂糖膠和大腸桿菌感受態細胞 DH10B購自Invitrogen公司;限制性內切酶HindⅢ，NotⅠ，XbaⅠ購自Fermentas公司;Taq DNA Polymerase和dNTP購自TaKaRa公司;脈沖場凝膠電泳(PFGE)所需的Marker購自NEB公司.

1.2 方法

1.2.1 高分子量基因組DNA的制備

接種C.necator JMP134菌株于LB液體培養基培養至OD=0.8～1.0，加入終質量濃度為180 μg/μL的氯霉素培養 1 h.離心沉淀菌體，用 STE (100 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0)洗滌菌體，然后用STE重懸，至終質量濃度約為109個細胞/mL.加入等體積的45℃預熱的1%低熔點瓊脂糖，混勻后分裝入瓊脂糖凝膠塊模子(BIO-RAD Plug Mold)中，4℃放置10 min使其凝固.凝固后置于 5倍體積 Lysis buffer (10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，1%N-月桂酰肌氨酸鈉，0.2%脫氧膽酸鈉，1 mg/mL溶菌酶)中，37℃處理1 h.將Lysis buffer更換為ESP(1%N-月桂酰肌氨酸鈉，0.5 mol/L EDTA，1 mg/mL蛋白酶K)，50℃繼續處理16 h［7］.用TE(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH= 8.0)洗滌膠塊，并用苯甲基磺酰氟(PMSF)終止蛋白酶K的反應，最后置于0.1 mol/L EDTA中保存待用.

1.2.2 文庫構建

在正式酶切之前，需預先對酶切條件進行摸索.將一個DNA膠塊平均分成8份置于離心管中，加入30倍體積酶切緩沖液(不含BSA)，冰上平衡1 h(每0.5 h更換一次緩沖液).吸出上清后，加入5倍體積的酶切緩沖液(1×HindⅢ酶切緩沖液，1/10 BSA)以及所需的酶，冰上平衡1 h，然后于37℃進行酶切反應45 min.設置酶量梯度，每管加入1/8 DNA膠塊，用不同量的HindⅢ進行部分酶切.酶切結果經脈沖場凝膠電泳(BIO-RAD CHEF MAPPERTM)檢測(1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，6 V/cm電壓，40 s脈沖時間，14℃電泳16 h)，選取能最大量地產生所需范圍片段的酶切條件作為正式酶切條件.酶切反應結束后立即將反應管插入冰中，加入1/10體積的0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)終止反應.

正式酶切時，視情況取適量的DNA(4～6個膠塊，每塊的DNA含量為5～10 μg)，以確定的最佳條件進行部分酶切.先經第一輪脈沖場凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5×TBE，6 V/cm電壓，90 s脈沖時間，14℃電泳16 h)進行酶切片段的分離，再更換電泳條件進行第二輪電泳(1%瓊脂糖凝膠，0.5× TBE，4 V/cm電壓，5 s脈沖時間，14℃電泳5 h)壓縮目標范圍內的DNA，最后對照分子Marker切下含有100～300 kb DNA的凝膠塊放入透析袋中，電洗脫回收所需的DNA片段［8］.

通過與λDNA標準濃度比較確定得到的大片段DNA的濃度，按載體和插入片段的摩爾濃度比為5∶1的比例在50 μL連接體系中于16℃下連接10 h，后經65℃滅活連接酶，脫鹽后進行電擊轉化［9］(BIO-RAD Gene Pulser XcellTM電激儀，0.1 mm BIO-RAD電擊杯，1 800 V/cm，200 Ω，25 μF).

1.2.3 文庫插入片段大小檢測

隨機挑取96個克隆接種到含12.5 μg/mL氯霉素的LB培養基中培養過夜.用堿裂解法提取BAC質粒，NotⅠ酶切后，進行脈沖場凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠0.5×TBE，6 V/cm電壓，0.1～40 s脈沖時間，14℃電泳16 h)以確定插入片段的大小.

1.2.4 BAC文庫的篩選

根據NCBI上所獲得的C.necator JMP134苯酚羥化酶大亞基基因的phlN2序列，設計引物：jmp2f (5’-ATGGATACCCGCGTTGCCAAGAAGA-3’)，jmp2r (5’-ACCGAAGGTGACGGTGCTCATGTCG-3’).隨機挑取文庫單克隆至96孔板(板內預加了200 μL含12.5 μg/mL氯霉素的LB液體培養基)，37℃靜置培養文庫克隆過夜.將每塊板的橫列12個樣品合并為1個樣品，縱列8個樣品合并為1個樣品，因此每塊板共得到20個樣品.分別將這20個樣品接種至3 mL含12.5 μg/mL氯霉素的LB液體培養基中培養，抽提BAC質粒，以提取的質粒DNA為模板，通過引物jmp2f/jmp2r進行PCR擴增，快速篩選含有目標基因的克隆.

1.2.5 目的條帶序列測定

PCR擴增出的陽性DNA片段經PCR產物快速回收試劑盒(杭州Axygen公司)純化后，與pMD18-T (TaKaRa公司)載體連接，轉化大腸桿菌DH5α.挑取正確的轉化子，抽提質粒，通過引物M13+(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)和M13-(5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’)進行雙向測序(測序儀為MegaBACE 4500 DNA Analysis System，Amersham Biosciences).

2 結果與分析

2.1 文庫的構建

高質量BAC文庫構建的關鍵步驟之一就是獲得較高純度的大分子量DNA.本研究采用直接包埋C.necator JMP134細胞的方法制備的大分子量DNA具有較高的DNA得率和質量(見圖1)，符合BAC文庫構建的要求.

圖1 C.necator JMP134基因組大分子量DNAFig.1 High-molecular-weight DNA of C.necator JMP134

為了確定所制備的含有DNA的瓊脂糖凝膠塊的最佳部分酶切條件，設計使用0，0.05，0.1，0.5，1，10 U不同酶量對1/8個瓊脂糖凝膠塊進行酶切實驗，結果如圖2所示(1～6分別為用0，0.05，0.1，0.5，1，10 U酶量對基因組DNA進行酶切).由圖可見，1 U HindⅢ酶切產生的片段主要集中在100～300 kb之間，可確定其為最佳酶量.使用1 U酶量對4個膠塊進行部分酶切，回收片段與載體連接后，滅活脫鹽，電激轉化，挑取9 600個陽性克隆，保存于100塊96孔板中，形成 C.necator JMP134菌株的BAC文庫.

2.2 文庫的鑒定

為了鑒定文庫平均插入片段的大小，隨機挑取96個克隆，經NotⅠ酶切以及脈沖場凝膠電泳檢測后發現，NotⅠ酶切后產生的條帶較多，這給鑒定文庫插入片段的大小帶來了不便，其主要原因在于C.necator JMP134菌株的GC含量(64.43%)較高.為了更準確地確定文庫插入片段的大小，在對 C.necator JMP134菌株的基因組進行分析后，選用XbaⅠ進行酶切(見圖3)，并對文庫插入片段的大小進行了鑒定.

圖2 最佳酶切條件的確定Fig.2 Determination of optimal partial digestion conditions

圖3 BAC克隆XbaⅠ酶切鑒定Fig.3 Evaluation of insert size digested with XbaⅠ

XbaⅠ的酶切結果表明，99%的克隆含有插入片段，插入片段的大小分布在20～120 kb之間，平均大小約為65 kb.圖4為BAC文庫的插入片段大小分布圖，其中約有61%的克隆插入片段大小大于50 kb.根據平均插入片段(約65 kb)和文庫的總容量(約9 600個克隆)計算，此文庫覆蓋了約6 240 Mb的基因組序列.按照C.necator JMP134菌株基因組7.25 Mb的大小估算，此文庫約覆蓋了C.necator JMP134菌株基因組的860倍.

圖4 C.necator JMP134 BAC文庫插入大小分布Fig.4 Insert size distribution of C.necator JMP134 BAC library

2.3 文庫的使用

為了進一步鑒定文庫和驗證篩選體系，本研究根據C.necator JMP134菌株的2號基因簇苯酚羥化酶大亞基基因 phlN2的序列，合成了特異引物jmp2f/jmp2r，并通過PCR篩選從文庫隨機的800個單克隆中篩選到了11個陽性克隆(見圖5).對這11個陽性克隆的PCR擴增phlN2的產物序列進行了測定，結果顯示，所有克隆的PCR擴增序列均與C.necator JMP134菌株基因組上phlN2基因的序列完全一致，表明所構建的文庫克隆不存在基因組序列上的突變.用XbaⅠ酶對這11個克隆的插入片段大小進行了鑒定，脈沖場電泳結果表明，11個陽性克隆的平均插入片段大小在50 kb以上，能夠滿足篩選完整的苯酚降解基因簇片段的需要(見圖6).同時也說明該文庫能夠用于快速、有效地分離大片段功能基因簇序列，驗證了該BAC文庫的有效性和篩選方法的優越性.

3 討論

BAC載體克服了酵母人工染色體(yeast artificial chromosome，YAC)載體的不足，具有容量大、遺傳穩定性好、重組DNA易分離等優點，近年來己經逐漸成為物理圖譜構建、全基因組測序和基因圖位克隆等研究中應用最廣泛的載體系統之一［10］.盡管BAC文庫構建技術已經經歷了近20年的發展，技術日趨完善，但是構建BAC文庫仍然是一件費時費力的工作，在整個文庫的構建過程中高分子量插入片段的制備是關鍵所在.為了盡量提高回收片段中具有酶切粘性末端的DNA片段的比例，首先，要選取合適的酶切條件;其次，由于載體有優先連接較小片段的趨勢，因此，為了保持較大的平均插入，在回收的片段中應盡量去除小分子DNA，這需要通過脈沖場電泳來完成.但是由于DNA片段經常發生糾結纏繞，很難通過脈沖場徹底分離，所以不可避免地會在其中混有小片段.此外，過大的片段也不利于連接，會導致連接效率和克隆數的明顯下降.C.necator JMP134為革蘭氏陰性菌，細胞壁脆弱，將菌體直接包埋后裂解可得到較高濃度的高分子量DNA，為酶切獲得高質量的連接片段提供了有力保障.

圖5 C.necator JMP134 BAC文庫中11個phlN2陽性克隆的PCR擴增圖譜Fig.5 PCR amplification of the 11 phlN2 positive clones

圖6 C.necator JMP134的 11個 phlN2陽性克隆XbaⅠ酶切圖譜Fig.6 XbaⅠrestriction map of the 11 phlN2 positive clones of C.necator JMP134

許多研究者在構建BAC文庫時多采用兩次分離回收的方法［11-12］.陳凡國等［13］對兩種選擇方法進行了比較，發現在其他條件相同的情況下，兩次選擇法得到的DNA連接(以100～150 kb為例)的轉化效率較高，轉化后插入片段較整齊，空載率低，但是得到的用于連接的大片段DNA濃度較低，浪費嚴重;而一次選擇法雖然克服了兩次選擇法的缺點，但轉化后的平均插入片段較小，空載率也很低.本研究采用一次分離回收的方法，同樣取得了較大的外源片段插入，因此，采用適當的分離程序對酶切后的片段進行分離并選取較大的片段范圍回收，同樣可以提高外源片段的平均插入大小，獲得較理想的結果.

轉化也是文庫構建中很重要的實驗步驟，直接決定了最后所得文庫的克隆數目.轉化用的感受態細胞應盡量避免凍融，因為凍融一次后，感受態的效價往往會大幅降低.在轉化操作的整個過程中，動作要快，應在電擊后迅速加入恢復培養基，其中從電擊到向電擊杯中加入培養基的時間非常關鍵.耿波等［10］研究發現，拖延 1 min將使轉化效率降低67%，而拖延10 min將使轉化效率降低95%.此外，將連接產物滅活可以提高轉化效率，轉化條件也可以影響文庫插入片段的大小［14］.

綜上所述，根據實驗數據，本研究所構建的BAC文庫約覆蓋了C.necator JMP134菌株基因組的860倍，因此，整個文庫具有很好的基因組覆蓋率.本研究成功構建了高質量、高覆蓋率的C.necator JMP134菌株的 BAC文庫，理論上篩選出任一C.necator JMP134基因的概率為99.99%，適合于單基因的克隆和分離，為進一步對苯酚降解基因簇，以及該菌株其他重要生理代謝途徑相關基因簇的克隆和功能分析打下了堅實基礎.

［1］ PEREZ-PANTOJAD，DELAL R，PIEPERD H，et al.Metabolic reconstruction of aromatic compounds degradation from the genome of the amazing pollutantdegrading bacterium Cupriavidus necator JMP134［J］.FEMS Microbiol Rev，2008，32(5)：736-794.

［2］ FUKUMORIF，HAUSINGERR P.Alcaligenes eutrophus JMP134“2，4-dichlorophenoxyacetat emonooxygenase”is an alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase［J］.J Bacteriol，1993，175(7)：2083-2086.

［3］ FARHANAL，NEW PB.The 2，4-dichlorophenol hydroxylase ofAlcaligeneseutrophusJMP134 is a homotetramer［J］.Can J Microbiol，1997，43(2)：202-205.

［4］ KIMY，HARKERA R.Cloning and characterization of the regulatory genes phlR1 and phlR2 involved in phenol metabolism from Alcaligenes eutrophus JMP134［J］.Mol Cells，1997，7(5)：620-629.

［5］ KIMU J，SHIZUYAH，DEJONGP J，et al.Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector［J］.Nucleic Acids Res，1992，20 (5)：1083-1085.

［6］ SHIZUYAH，BIRRENB，KIMU J，et al.Cloning and stablemaintenanceof 300-kilobase-pairfragmentof human DNA in Escherchia coli using an F-factor-based vector［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89(18)：8794-8797.

［7］ STEIN JL，MARSH T L，WU K Y，etal.Characterization of uncultivated prokaryotes：isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon［J］.J Bacteriol，1996，178(3)：591-599.

［8］ LUOM，WINGR.An improved method for plant BAC library construction［M］.Totowa，NJ：Humana Press Inc，2003：3-20.

［9］ ZHANGH B，CHOIS，WOOS，et al.Construction and characterization of two rice bacterial artificial chromosome libraries from the parents of a permanent recombinant mapping population［J］.Mol Breed，1996，2(1)：11-24.

［10］ 耿波，關云濤，孫效文.黑龍江野鯉細菌人工染色體基因組文庫構建［J］.中國水產科學，2009，16(2)：165-172.

［11］ NAMY W，LEEJ R，SONGK H，et al.Construction of two BAC libraries from cucumber(Cucumis sativus L.) and identification of clones linked to yield component quantitative trait loci［J］.Theor Appl Genet，2005，111 (1)：150-161.

［12］ 孟祥宗，楊曉武，管禎瑋，等.鹽藻(Dunaliella viridis)細菌人工染色體文庫的構建和鑒定［J］.上海大學學報：自然科學版，2007，13(1)：88-93.

［13］ 陳凡國，姜濤，張學勇.BAC文庫構建中的幾個技術問題探討［J］.生物技術，2002，12(2)：28-29.

［14］ SHENGY，MANCINOV，BIRRENB.Transformation of Escherichia coli with large DNA molecules by electroporation［J］.Nucleic Acids Res，1995，23(11)：1990-1996.