季節性流感病毒H1N1實時熒光定量PCR檢測方法的建立

許黎黎，鮑琳琳，秦 川

（中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，其流行特點是傳播迅速，波及范圍廣。迄今為止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，給人類社會的經濟及健康造成了巨大損失［1］。

流感病毒屬于正黏病毒科，其基因組為分節段負鏈RNA，根據病毒核衣殼蛋白（NP）和基質蛋白（M）不同可分為甲、乙、丙三種型別，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群中主要的流行病毒，甲型流感病毒根據病毒表面血凝素抗原的不同分為16個HA亞型；根據神經氨酸酶抗原的不同分為9個NA亞型［2］。甲型流感病毒中的 H1N1亞型曾經在1918年引起世界流感的大流行，自 1997年以后，H1N1亞型與 H3N2亞型交替在人群中流行。從2002開始我國的流感一直由H3N2占優勢，持續了近3年后，2005年的9月以后H1N1亞型流感毒株重新成為我國的流感流行的優勢毒株［3，4］，已對人類的健康及社會經濟造成極大的威脅。因此，研究快速、敏感、特異的實驗室診斷技術是早期發現病人，掌握傳播途徑和制定預防措施的根本。

目前國內診斷流感病毒的主要方法包含病毒分離和血清學診斷反應等，但這些方法費時費力，不宜于疾病初期的快速診斷與篩查，而核酸檢測靈敏度高、快速、特異等優勢決定了其在臨床檢測中的重要地位，傳統的聚合酶鏈式反應（PCR）不僅無法對樣本中的病毒進行定量檢測，而且擴增反應后需要電泳檢測，這不僅不適于大批量樣本的篩選，而且容易因操作污染造成假陽性。近年發展起來的實時熒光定量 PCR（Real-time quantitative PCR）是一種在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號的積累實時檢測整個PCR過程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法，不僅具有敏感性高、特異性強、重復性好等優點，而且通過分析軟件對數據進行分析整理，結果更為準確直觀，并有效地減少了假陽性發生的機會，已成為病原體檢測的重要方法。

SYBR GreenⅠ是一種非探針型熒光染料，可以與雙鏈DNA非特異性結合而發出熒光，由于其相對探針型染料價格低廉，因此已被廣泛應用于不同病原體的實時熒光定量檢測實驗中。從目前的文獻查詢結果得知，尚未有基于SYBR GreenⅠ染料法的季節性流感病毒H1N1的實時熒光定量PCR檢測方法的報道。本實驗中，我們建立了一種可以快速定量檢測季節性流感病毒H1N1的方法，靈敏度高，可用作基礎及臨床實驗室對季節性流感病毒H1N1感染的輔助診斷方法和臨床效果的監測手段。

1 材料和方法

1.1 材料

季節性流感病毒H1N1分離株A/Brisbane/59/ 2007由香港大學陳鴻霖教授提供，MDCK細胞由本所保存，按常規方法傳代培養。RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自 QIAGEN公司，逆轉錄試劑盒SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System 購自Invitrogen公司，熒光染料 Power SYBR Green PCR Master M ix，48孔0.2 m L PCR反應管 Fast Optical 48-well RXN Plate，及光學反應蓋膜48-Well Optical Adhesive Film 25PK均購自ABI公司，實時熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne系列產品。

1.2 方法

1.2.1 特異性引物的設計與合成：

選擇季節性流感病毒H1N1的保守基因NP基因作為檢測靶目標，首先從GenBank數據庫中下載季節性流感病毒H1N1、H3N2、高致病性禽流感病毒H5N1、2009年新型甲型H1N1病毒等代表株的NP基因全序列，使用Clustal W軟件進行序列同源性比對分析，篩選出季節性流感病毒H1N1特異性的保守序列作為引物候選區域。

應用Primer Express及Primer Prem ier 5.0軟件包對候選引物進行進一步配對及篩選，得到最優特異性檢測引物。引物設計及挑選遵循下列原則：①選用的引物位于季節性流感病毒H1N1 NP基因的保守區，與新型H1N1、H3N2、H5N1等其他亞型無交叉反應；②引物長度為18～25個堿基；③引物的GC％要求在40％～60％，理論Tm＞50℃；④引物自身之間盡可能避免堿基配對；⑤擴增的目的片段長度介于100～500 bp之間。

1.1.2 檢測標準品的制備

24孔細胞培養板培養的 MDCK細胞接種 A/ Brisbane/59/2007毒株48 h后，取100μL細胞培養上清，按照RNeasy Mini Kit說明書提取病毒RNA，溶于30μL RNase-free H2O中。

取8μL病毒 RNA，按照 SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System說明書合成第一鏈cDNA。

基于NP基因5’及3’端序列設計并合成PCR引物，由病毒全長 cDNA擴增出 NP基因。瓊脂糖凝膠電泳檢測NP基因的擴增情況，并對目的條帶進行切膠回收及純化。

用紫外分光光度計對回收后的NP全長基因進行核酸濃度測定，并換算成拷貝數。

1.1.3 實時熒光定量PCR標準曲線的建立

將計算好拷貝數的標準品做10倍梯度稀釋，從1×1010copies/μL稀釋至1×102copies/μL，共9個梯度。

配置 real-time PCR Mix，按順序依次加入： SYBR Green PCR Master Mix（2×）10μL；5μM正反向引物各1μL；RNase-free H2O 6μL。將混合液均分至48孔0.2 m L PCR反應管 Fast Optical 48-well RXN Plate中，每管各加不同濃度標準品2μL，貼上光學反應蓋膜 48-Well Optical Adhesive Film 25PK。打開 ABI STEPONE PCR儀及電腦，運行real-time PCR主程序。將48孔反應板放置在PCR儀上，開始以下 PCR程序：94℃預變性3 m in；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，重復35次，每個循環結束后收集熒光信號。熔解曲線從 60℃至 95℃，每0.3℃讀取一次吸光值。

1.1.4 重復性測試

每個梯度樣品均平行設三個重復樣，PCR重復三次，最終通過 MicroOffice Excel軟件計算循環閾值（Ct）的平均值、標準差（SD）及變異系數（CV）。

2 結果

2.1 季節性流感病毒H1N1的特異性引物的設計

經序列同源性比對分析，篩選出季節性流感病毒H1N1特異性的保守序列作為引物候選區域后，再依據引物設計及挑選基本原則，本實驗最終采用的特異性檢測引物序列如下：SF-F（1141-1160）：5’-ctgagaagcagatactgggc-3’，SF-R（1460-1480）：5’-ctgcattgtctccgaagaaat-3’。擴增目的片段長度為340 bp，退火溫度55℃。

2.2 季節性流感病毒H1N1N基因標準品的制備

基于NP基因5’及3’端序列設計并合成PCR引物，由 A/Brisbane/59/2007毒株全長 cDNA擴增出NP基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測NP基因的擴增情況，結果如圖1所示。對目的條帶（1497 bp）進行切膠回收及純化后，用紫外分光光度計對回收后的NP全長基因進行核酸濃度測定，依據公式計算出拷貝數。

2.3 擴增曲線、標準曲線、熔解曲線的建立及靈敏度和特異性評估

圖1 季節性流感病毒H1N1全長N基因的PCR擴增及檢測Fig.1 PCR amplification and detection of full length N gene of seasonal influenza H1N1 virus

將標準品做10倍梯度稀釋，從1×1010copies/ μL稀釋至1×102copies/μL，共9個梯度。標準品的擴增曲線如圖2所示，標準曲線如圖3所示，其中不同梯度標準品間線性關系（R2）達0.999，斜率介于-3.0至 -3.5之間，為 -0.3433，擴增效率為95.572％，亦位于標準擴增效率范圍內。熔解曲線

圖2 實時熒光定量PCR檢測季節性流感病毒H1N1的擴增曲線Fig.2 Amplification curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

圖3 實時熒光定量PCR檢測季節性流感病毒H1N1的標準曲線Fig.3 Standard curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

圖4 實時熒光定量PCR檢測季節性流感病毒H1N1的熔解曲線Fig.4 Melting curve of real-time PCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

如圖4所示，所有標準品均在83.2℃出現尖且窄的特異性熔解峰。將熒光定量PCR結果進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖5所示，特異性條帶亮度隨模板拷貝數梯度降低而等倍下降。綜上評估結果，可見本定量檢測系統靈敏度達102copies/μL，無非特異性擴增，定量結果真實可靠。

圖5 實時熒光定量PCR檢測季節性流感病毒H1N1后瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.5 Results of electrophoresis after the real-timePCR for seasonal influenza H1N1 virus detection

2.4 重復性驗證

將9個梯度樣品均平行設三個重復樣，PCR重復三次，統計Ct的的平均值、標準差（SD）及變異系數（CV），結果如表1所示，CV值均低于1％，證明所有數據重復性良好，檢測系統非常穩定。

表1 實時熒光定量PCR檢測季節性流感病毒H1N1數據的重復性驗證Tab.1 Reproducibility of the real-time PCR for seasonal influenza virus H1N1 detection

3 討論

流感病毒的實驗室診斷方法包括病毒細胞培養、血清學診斷以及抗原檢測。病毒通過感染敏感的組織細胞可以被分離鑒定出來，這可以作為流感病毒感染最直接，最可靠的依據。另外，急性期血清較恢復期血清抗體有4倍增加也是流感病毒感染的標準。但是前者耗時長，一般來說細胞培養需要3～4 d，而后者需采集患者急性期及恢復期雙份血清進行抗體測定，且很容易出現與其他亞型的交叉反應，這些缺陷限制了兩種方法在臨床上的快速診斷。抗原的直接檢測包括對病毒結構蛋白以及核酸的檢測。病毒結構蛋白的檢測基于抗原抗體的反應、偶聯酶或者化學生色原或者熒光染料，包括免疫熒光（immunofluorescence，IF）、酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA），直接或間接免疫熒光試驗的敏感度波動在40％ ～100％，特異性在86％ ～99％，但是由于需要熒光顯微鏡特殊儀器而限制了其在臨床上的應用。目前對流感病毒抗原核酸的最優檢測手段是實時熒光定量PCR反應，它將高靈敏性、高特異性和高準確性結為一體，克服了傳統PCR費時、易污染、低通量等缺點，可對樣本中的流感病毒核酸進行準確的定量檢測［5-7］。

SYBR GreenⅠ是一種結合于雙鏈 DNA小溝中的熒光染料，與雙鏈 DNA結合后，其熒光大大增強，這一性質使其用于擴增產物的檢測非常理想。在 PCR反應體系中，加入過量SYBR GreenⅠ熒光染料，其特異性地摻入 DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與 PCR產物的增加完全同步［8］。

SYBR GreenⅠ在核酸的實時檢測方面有很多優點，由于它與所有的雙鏈 DNA相結合，因此通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA熔點的性質，通過熔解曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，因而可以區分非特異擴增，進一步地還可以實現單色多重測定。此外，由于一個 PCR產物可以與多分子的染料結合，因此SYBR GreenⅠ的靈敏度很高。但是，由于 SYBR GreenⅠ與所有的雙鏈 DNA相結合，因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產物的影響［9］。

NP基因在流感病毒的8個基因片段中相對保守［1］，選取NP基因作為擴增的模板能兼顧同亞型不同毒株之間的保守序列，保證了該檢測方法對于H1N1病毒的通用性。同時，在進行引物設計時，注意同流感病毒H3、H5、H7、H9等其它亞型之間的序列比較，選取的序列應與其它亞型有較大差異，以保證擴增的特異性。將上、下游引物進行BLAST分析，結果發現與上、下游引物完全匹配的序列都是H1N1亞型序列，除此以外沒有找到與引物有很大相似性的其它核酸序列。PCR產物電泳檢測沒有發現任何非特異性條帶，表明PCR擴增的特異性。

季節性流感病毒H1N1的RT-PCR檢測靈敏度在1000 copies/μL左右，從病毒核酸提取、RT-PCR反應到瓊脂糖凝膠電泳，整個過程大約需要6～7 h左右，而本方法靈敏度可達100 copies/μL，比普通RT-PCR提高了10倍左右，從核酸提取至完成檢測，僅需要4 h左右，并且能同時實現多樣本的高通量檢測。

綜上所述，我們建立了一套快速定量檢測季節性流感病毒H1N1的方法，特異性及靈敏度高，可用作基礎及臨床實驗室對季節性流感病毒H1N1感染的輔助診斷方法和臨床效果的監測手段，對實驗操作者要求相對較低，具有實際的臨床應用價值。

（本研究成果已申請專利，專利受理號： 201010278683.9。感謝香港大學陳鴻霖教授提供季節性流感病毒H1N1分離株A/Brisbane/59/2007。）

［1］Cheung TK.and LL Poon.Biology of influenza a virus［J］.Ann N Y Acad Sci，2007.1102：p.1-25.

［2］Tang JW，et al.Emerging，novel，and known influenza virus infections in humans［J］.Infect Dis Clin North Am.24（3）：p.603-17.

［3］Webster RG，et al.Evolution and ecology of influenza A viruses［J］.Microbiol Rev，1992.56（1）：p.152-79.

［4］Faruqui F.and D Mukundan.2009 pandemic influenza：a review［J］.Curr Opin Pediatr.22（4）：p.530-5.

［5］Carr MJ，et al.Development of a real-time RT-PCR for the detection of swine-lineage influenza A（H1N1）virus infections［J］.JClin Virol，2009.45（3）：p.196-9.

［6］Evaluation of rapid influenza diagnostic tests for detection of novel influenza A（H1N1）Virus-United States，2009［J］.MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2009.58（30）：p.826-9.

［7］Jiang T，et al.Development of a real-time RT-PCR assay for a novel influenza A（H1N1）virus［J］.JVirol Methods，2009.

［8］Liu S，et al.A SYBR Green I real-time RT-PCR assay for detection and differentiation of influenza A（H1N1）virus in swine populations［J］.JVirol Methods，2009.162（1-2）：p.184-7.

［9］Ellis J，et al.Evaluation of four real-time PCR assays for detection of influenza A（H1N1）v viruses［J］.Euro Surveill，2009.14（22）.