延衰合劑對D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠睪丸及血清睪酮的影響

黃和賢 曹文富 彭 爽 欒增強 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

延衰合劑對D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠睪丸及血清睪酮的影響

黃和賢 曹文富 彭 爽 欒增強 (重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016)

目的 觀察延衰合劑(YSM)對D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠睪丸及血清睪酮的影響。方法 選昆明系雄性小鼠，用D-半乳糖建立衰老模型。應(yīng)用光鏡、電鏡技術(shù)觀察延衰合劑治療前后衰老小鼠睪丸的形態(tài)學(xué)改變;酶聯(lián)免疫分析法檢測血清睪酮的變化。結(jié)果 衰老小鼠生精細胞減少，生精小管變細，血清睪酮含量明顯降低;用藥后，生精小管增粗，生精細胞增多，間質(zhì)細胞增多，血清睪酮含量增加(P＜0.05)。延衰合劑高劑量組作用優(yōu)于補腎益壽膠囊組及延衰合劑低中劑量組(P＜0.05)。結(jié)論 延衰合劑可以改善衰老小鼠睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)，抑制衰老小鼠血清睪酮含量的下降，具有一定的延緩衰老的作用。

延衰合劑;D-半乳糖;衰老小鼠;睪丸;血清睪酮

衰老是生物體在生命過程中形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能逐漸衰退的綜合現(xiàn)象。衰老過程所呈現(xiàn)的退行性變化主要表現(xiàn)為體內(nèi)細胞數(shù)目減少，組織與器官萎縮，重量減輕，從而導(dǎo)致生物體的多種生理功能障礙。近年研究表明人體衰老與性腺結(jié)構(gòu)和功能的退化密切相關(guān)〔1〕。人體衰老時睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生退變，性激素水平降低已被證實。因此本實驗采用D-半乳糖誘導(dǎo)建立亞急性衰老小鼠模型，應(yīng)用光鏡、電鏡及酶聯(lián)免疫分析法，觀察延衰合劑對衰老小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)及血清睪酮的影響，從形態(tài)及功能的層面探討具有補腎填精、益氣活血功效的中藥復(fù)方延緩衰老的相關(guān)機制，為中醫(yī)藥延緩衰老提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 昆明種雄性小鼠60只，SPF級，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，2～3月齡，體重(20±2)g，動物使用許可證:SCXK(渝)20070001。

1.1.2 藥物與試劑 延衰合劑中藥材由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科提供，制成含生藥濃度2 g/ml的水煎劑，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｑa腎益壽膠囊由太極集團重慶涪陵制藥廠生產(chǎn)(批號:國藥準字Z50020569)，規(guī)格為每粒0.3 g。根據(jù)人和小鼠的劑量轉(zhuǎn)換用生理鹽水配成18 g/kg的水溶劑，D-半乳糖(美國Amersco公司)用生理鹽水配成6%的濃度，血清睪酮ELISA檢測試劑盒(重慶升博科技有限公司)。

1.1.3 主要儀器 光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)，透射電子顯微鏡(Hitachi7500)，酶標儀(美國MD)低溫高速離心機(德國sigma)，電子天平(島津SHIMADZU)，顯微圖像分析儀(Leica CTR6000)隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，4℃冰箱(新飛FRESTECH)以上儀器由重慶醫(yī)科大學(xué)眼科實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將60只昆明雄性小鼠隨機分為正常對照組、衰老模型組、補腎益壽膠囊組、延衰合劑低劑量組、延衰合劑中劑量組、延衰合劑高劑量組，每組10只。各組小鼠分籠在相同條件下喂養(yǎng)，自由進食飲水，除正常對照組每日頸背部皮下注射生理鹽水0.04 ml外，其余各組小鼠均每日頸背部皮下注射等體積的D-半乳糖(120mg/kg)，每日1次，連續(xù)8 w，形成糖代謝紊亂所致的亞急性衰老模型。造模同時，正常對照組每日生理鹽水0.4m l灌胃，補腎益壽膠囊組灌胃等體積的補腎益壽膠囊水溶劑，延衰合劑分別灌胃等體積的延衰合劑水煎劑(低劑量組9 g/kg，中劑量組18 g/kg，高劑量組36 g/kg)，每日1次，連續(xù)8 w。

1.2.2 取材 于末次給藥后1 h稱量各組小鼠體重，各組小鼠用10%水合氯醛(0.1 ml/kg)腹腔注射麻醉后摘眼球取血，并按光鏡及電鏡標本需要取下相應(yīng)的睪丸稱濕重后固定，最后頸椎脫臼致死。

1.2.3 觀察指標及方法 ①一般情況:觀察造模后各組小鼠體重、精神狀態(tài)、毛發(fā)、活動力等情況。②血清睪酮檢測:將取出的血液室溫自然凝固20 min后3 000 r/min低溫離心15 min分離血清，置4℃冰箱中保存，用ELISA方法測定樣品睪酮含量，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。③睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察:取雙側(cè)睪丸，一側(cè)睪丸用4%多聚甲醛固定，常規(guī)組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，制成光鏡標本并拍照分析;另一側(cè)睪丸活體白膜下固定后修取1mm3組織塊置2.5%緩沖戊二醛中固定2 h，磷酸緩沖液沖洗后，1%四氧化鋨(OSO4)固定1 h，逐級酒精、丙酮脫水，EPon812包埋，超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染，透射電鏡觀察拍照。用圖像分析系統(tǒng)對每組每只小鼠睪丸隨機測量30個橫切的生精小管直徑。并計算30個由3個生精小管圍成的三角區(qū)內(nèi)的間質(zhì)細胞數(shù)。在光鏡及電鏡下觀察生精小管內(nèi)生精細胞及睪丸間質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 衰老模型組小鼠與正常對照組比較體重減輕，精神差，活力下降，毛發(fā)無光澤，部分可見毛發(fā)脫落。補腎益壽膠囊組及延衰合劑各劑量組較模型組體重增加，精神狀態(tài)好，活力強，毛發(fā)光澤，其中以延衰合劑高劑量組改善最明顯。見表1。

2.2 各組小鼠血清睪酮含量的變化 補腎益壽膠囊組及實驗組的血清睪酮水平較模型組均有升高。與正常對照組相比，衰老模型組血清睪酮含量明顯降低(P＜0.05);與衰老模型組小鼠相比，用藥后延衰合劑低、中、高劑量組及補腎益壽膠囊組均可明顯抑制衰老小鼠血清睪酮含量的下降(P＜0.05)。延衰合劑高劑量組作用明顯優(yōu)于補腎益壽膠囊組及延衰合劑低、中劑量組(P＜0.05)。見表1。

2.3 各組小鼠睪丸生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)及間質(zhì)細胞的變化 與正常對照組相比，衰老模型小鼠生精小管直徑變小，生精細胞層數(shù)變少，睪丸間質(zhì)細胞數(shù)減少(P＜0.05);用藥后補腎益壽膠囊組、延衰合劑低、中、高劑量組生精小管直徑均變大(P＜0.05)，間質(zhì)細胞增多(P＜0.05)。延衰合劑高劑量組的變化比延衰合劑低、中劑量組及補腎益壽膠囊組更明顯(P＜0.05)。見表1。

2.4 光鏡照片 正常對照組小鼠生精小管橫切面可見生精小管界膜完整，基膜內(nèi)各級生精細胞及支持細胞排列整齊，生精小管內(nèi)各級生精細胞多在6～8層，管腔內(nèi)可見大量成熟的精子，支持細胞輪廓不清，核常呈不規(guī)則型。睪丸間質(zhì)細胞成群分布，圓形或多邊形，核圓居中，可有1～2個核仁。衰老模型組小鼠生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化:生精上皮變薄，生精細胞層數(shù)變少，排列疏松，間隙增大，各級生精細胞數(shù)量減少。補腎益壽膠囊組及延衰合劑各劑量組生精小管的形態(tài)結(jié)構(gòu)得到不同程度的恢復(fù)，表現(xiàn)為生精上皮變厚，生精細胞層數(shù)增多最多達5～7層，精子細胞及成熟精子增多，間質(zhì)細胞數(shù)量增多，其中補腎益壽膠囊組及延衰合劑高劑量組變化較延衰合劑低中劑量組明顯。見圖1。

2.5 電鏡照片 正常對照組睪丸間質(zhì)細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，可見管狀嵴線粒體，線粒體無腫脹，有少量脂滴，顯示出具有分泌類固醇激素細胞的形態(tài)特點，衰老模型組間質(zhì)細胞線粒體數(shù)量減少，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，溶酶體及脂滴明顯增多，還可見髓樣結(jié)構(gòu)及空泡，補腎益壽膠囊組及延衰合劑各劑量組睪丸間質(zhì)細胞線粒體數(shù)量明顯多于衰老模型組，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有所恢復(fù)，核內(nèi)染色質(zhì)分布較均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)較衰老模型組有明顯改善，延衰合劑高劑量組作用優(yōu)于延衰合劑低、中劑量組及補腎益壽膠囊組。見圖2。

表1 各組小鼠體重、生精小管直徑、睪丸間質(zhì)細胞數(shù)及血清睪酮比較(±s，n=10)

表1 各組小鼠體重、生精小管直徑、睪丸間質(zhì)細胞數(shù)及血清睪酮比較(±s，n=10)

與衰老模型組比較:1)P＜0.05;與延衰合劑高劑量組比較:2)P＜0.05

組別 體重 生精小管直徑(μm) 睪丸間質(zhì)細胞數(shù)(個) 血清睪酮(ng/dl)7.49正常對照組 49.39±2.731)2) 184.40 ±7.431)2) 304.80±10.001)2) 177.65±15.511)2)補腎益壽膠囊組 46.22±2.611) 157.30±7.391)2) 222.80±13.251)2) 148.36±5.921)2)延衰合劑低劑量組 42.92±3.551)2) 141.70±6.881)2) 199.70±14.671)2) 103.72±14.051)2)延衰合劑中劑量組 46.04±3.651)2) 149.90±8.931)2) 212.00±9.201)2) 130.30±10.581)2)延衰合劑高劑量組 48.51±3.201) 169.70±7.231) 237.30±13.681) 163.04±24.471)衰老模型組 39.84±3.91 134.20±5.92 169.70±9.26 66.13±1

圖1 各組小鼠生精小管形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的光鏡照片(HE，×400)

圖2 各組小鼠睪丸間質(zhì)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)電鏡照片(×10 000，75 nm)

3 討論

D-半乳糖所致衰老動物模型穩(wěn)定可靠，造模方法簡便易行，已成為國內(nèi)公認的衰老動物模型，在抗衰老藥物研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖可導(dǎo)致雄性大鼠原發(fā)性骨質(zhì)疏松和血清睪酮含量降低以及睪丸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本實驗采用此方法造模，形成糖代謝紊亂引起衰老。造模后衰老模型組一般情況與正常對照組相比體重明顯下降、活力降低、精神差、可見明顯毛發(fā)脫落，說明衰老模型建立成功，睪丸組織形態(tài)學(xué)改變與血清睪酮含量的明顯下降進一步給予支持。

衰老時睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生退變，睪丸間質(zhì)細胞數(shù)量減少，超微結(jié)構(gòu)改變，睪酮合成能力也明顯下降。研究表明D-半乳糖所致衰老小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)明顯老化，出現(xiàn)精子生成能力減弱，血清睪酮水平降低〔3〕。目前，針對雄激素缺乏所引起的相關(guān)癥狀，臨床上西醫(yī)多采用性激素替代治療〔4，5〕，睪酮治療能提高體能、提高骨密度、增加脂質(zhì)代謝、改善性功能等，但是外源性的雄激素補充治療引起的紅細胞增多、胰島素抵抗、前列腺癌、阻塞性黃疸、抑制精子產(chǎn)生的不良反應(yīng)日益引起人們的密切關(guān)注，特別是孫輝〔6〕等研究表明外源性雄激素能夠抑制精子發(fā)生，從而影響了雄激素補充治療的臨床應(yīng)用。

中醫(yī)認為，腎為先天之本，腎虛是人體衰老的根本原因，而瘀血和痰濁是促進衰老的重要因素。腎虛衰老學(xué)說認為腎中精氣由盛漸虧是導(dǎo)致機體組織結(jié)構(gòu)、生理功能和代謝功能逐漸衰退的內(nèi)在機制，補腎填精是延緩衰老的根本大法，但單純滋陰填精，難以化成腎中精血，而且精血不生，反易成陰凝之邪傷伐元氣。若純使用壯陽之品，或獲一時之效，但勢必耗損精血，使虛損益甚。故必須采取補腎填精，助陽化氣之法，同時加以活血化瘀化濁，使精生氣，氣生精，精氣充足，瘀血化，痰濁除，氣血運行通暢，從而推動臟腑功能，達到神聰形健，益壽延年的目的。

延衰合劑由刺五加、淫羊藿、熟地、制首烏、丹參、肉蓯蓉等12味中藥組成，具有補腎填精，益氣活血等功效。適用于臨床辨證屬腎精虧虛、氣虛血瘀等證型。現(xiàn)代研究表明刺五加具有神經(jīng)元保護、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用，刺五加苷可以提高D-半乳糖致衰老模型大鼠血清白細胞介素(IL-2)，IL-6水平，增強T淋巴細胞增殖功能而延緩免疫衰老〔7〕。淫羊藿苷可以提高亞急性衰老雄性大鼠雄激素水平，減少生殖細胞凋亡，改善睪丸組織的退行性變化，抑制生殖細胞衰老基因P16蛋白表達延緩性腺衰老。淫羊藿總黃酮可以通過下調(diào)促炎性細胞因子表達和上調(diào)抗炎性細胞因子表達達到干預(yù)炎性衰老的目的〔8〕。熟地黃能改善D-半乳糖致衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高腦組織超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性，減少丙二醛(MDA)、過氧化脂(LPO)含量，增強抗氧化能力，減緩腦細胞衰老的進程〔9〕。肉蓯蓉麥角甾苷能夠提高D-半乳糖衰老模型小鼠心腦組織端粒酶活性而延緩衰老〔10〕。延衰合劑中的其他中藥不僅符合中醫(yī)方藥配伍理論，而且也可從多途徑發(fā)揮整個方藥的協(xié)同延衰作用。補腎益壽膠囊可以改善腎氣虛患者的脂質(zhì)過氧化狀態(tài)和腎氣虛癥狀〔11〕，具有確切的延緩衰老作用，因此本實驗選擇補腎益壽膠囊為陽性對照藥。

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Effect of yanshuaim ixture on testiculus and serum testosterone in subacute aging m ice caused by D-galactose

HUANG He-Xian，CAO Wen-Fu，PENG Shuang，et al.
Department of Integrated Traditional Chinese M edicine and Western Medicine，the First Affiliated Hospital of Chongqing M edical University，Chongqing 400016，China

Objective To study the effect of yanshuaimixture on testiculus and serum testosterone in subacute agingmice.M ethods Themale Kunmingmice were selected to build agingmicemodel by D-galactose.The changes in morphology of testiculus were observed by lightmicroscope and electronmicroscopy after treated with yanshuaimixture.The changes of serum testosteronewere determined by ELISA.Results The spermatogenic cellswere reduced，seminiferous tubulewere thinned and serum testosterone levelwas decreased in agingmice，there was significant difference between model and normal control groups(P ＜0.05).After treatment，the testicles weight were increased，seminiferous tubulewere thickened and the number of spermatogenic cells and stromal cellswere increased，the serum testosterone contentwere increased(P＜0.05).The effect of yanshuaimixture hight-dose group were better than that of Bushenyishou capsules，yanshuaimixture low-dose and middle-dose groups(P＜0.05).Conclusions Yanshuaimixture could improve themorphology of testiculus in agingmice and could inhibit the decrease of serum testosterone of agingmice，which have postponing ageing role inmice.

Yanshuaimixture;D-galactose;Agingmice;Testiculus;Serum testosterone

R285.5

A

1005-9202(2011)12-2239-04

曹文富 (1962-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腎病及內(nèi)分泌代謝病研究與中藥新藥研發(fā)。

黃和賢(1984-)，男，在讀碩士，主要從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝病及腎病研究。

〔2010-07-05收稿 2010-09-27修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)