FKN對外周血單個核細(xì)胞ERK1/2活化和TNF-α表達(dá)的影響及ERK1/2的臨床作用

雷明明 孫 健 張學(xué)穎 金元哲 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽 0032)

FKN對外周血單個核細(xì)胞ERK1/2活化和TNF-α表達(dá)的影響及ERK1/2的臨床作用

雷明明 孫 健1張學(xué)穎 金元哲 (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院心內(nèi)科，遼寧 沈陽 110032)

目的 探討趨化因子(FKN)對單個核細(xì)胞細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達(dá)的影響及ERK1/2在其中的作用。方法 抗凝血用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞。將每份提取的單個核細(xì)胞分為3組:空白對照組、FKN組、FKN+PD98059(ERK特異性阻斷劑)組;分別應(yīng)用Western印跡法和酶聯(lián)免疫法檢測各組單個核細(xì)胞中磷酸化ERK1/2及TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果 FKN誘導(dǎo)組磷酸化的ERK1/2和TNF-α表達(dá)較空白組顯著增多(P＜0.05);PD98059組磷酸化的ERK1/2和TNF-α表達(dá)較FKN組顯著減少(P＜0.05)。結(jié)論 FKN-CX3CR1可能通過增加單個核細(xì)胞磷酸化ERK1/2和TNF-α的表達(dá)而促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展，F(xiàn)KN可能是通過ERK1/2途徑誘導(dǎo)單個核細(xì)胞TNF-α的表達(dá)。

動脈粥樣硬化;FKN;ERK1/2;腫瘤壞死因子

最近發(fā)現(xiàn)炎性內(nèi)皮細(xì)胞釋放一種新的趨化因子(fractalkine，F(xiàn)KN)，與自然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞上的受體趨化因子(CX3CR1)結(jié)合以后，可以增強NK細(xì)胞的殺傷力，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷;同時使單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、黏附，從而促進(jìn)動脈粥樣硬化(AS)的形成。目前，關(guān)于此趨化因子信號傳導(dǎo)機制尚不清楚，還沒有實驗證實FKN/CX3CR1系統(tǒng)引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)分子水平反應(yīng)。本實驗針對FKN/CX3CR1引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制研究FKN-CX3CR1、細(xì)胞外信號通路1/2(ERK1/2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之間的上下游關(guān)系，并探討ERK1/2在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人外周血濃縮白細(xì)胞、低糖DMEM(LGDMEM，Gibco)，優(yōu)等胎牛血清(FBS，Hyclone)，F(xiàn)icoll分離液(濃度1.077 g/ml，Pharmacia)，胰酶、乙二胺四乙酸(EDTA)(Promega)，兔抗人磷酸化ERK1/2單克隆抗體(R＆D Systems)，山羊抗兔抗體(IgG，Santa Cruz)，人TNF-αELISA定量檢測試劑盒(北京博蕾德生物科技有限公司)，重組人FKN(PeproTech Inc)，ERK特異性阻斷劑PD98059(ALEXIS)，兔抗β-tubulin抗體(Santa Cruz)，化學(xué)熒光劑(ECL)試劑盒(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生命科學(xué)部)。

1.2 方法

1.2.1 分離人外周血單個核細(xì)胞 無菌條件，F(xiàn)icoll密度梯度離心法從人外周濃縮白細(xì)胞中分離人單個核細(xì)胞。

1.2.2 Western印跡方法檢測單個核細(xì)胞磷酸化ERK1/2的含量 Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)并計數(shù)后，將1×107個單個核細(xì)胞(2 m l)/孔鋪于六孔板中，實驗分組如下:①空白對照組:單個核細(xì)胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，加入FKN溶媒對照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min。②FKN組:在單個核細(xì)胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，加入 FKN(終濃度為0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min。③FKN+PD98059組:在單個核細(xì)胞中加入PD98059(終濃度為50 μmol/L)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，加入 FKN(終濃度為 0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育45 min。按照常規(guī)Western印跡方法對上述各組ERK1/2和β-tubulin進(jìn)行檢測。結(jié)果判定:磷酸化ERK1/2相對積分光密度值=磷酸化ERK1/2條帶積分光密度值/β-tubulin條帶積分光密度值。

1.2.3 ELISA方法檢測單個核細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量

1.2.3.1 分組 用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整人外周血單個核細(xì)胞濃度至5×106個單個核細(xì)胞/m l，接種于96孔板中，每孔200μl，實驗分為3組，每組2個復(fù)孔:①空白對照組:單個核細(xì)胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，加入FKN溶媒對照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。②FKN組:在單個核細(xì)胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后，加入FKN(終濃度為0.5μg/m l)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 24 h。③FKN+PD98059組在單個核細(xì)胞中加入 PD98059(終濃度為50 μmol/L)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 2 h后，加入 FKN(終濃度為 0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。

1.2.3.2 ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清中TNF-α含量 收集各組單個核細(xì)胞的培養(yǎng)上清，按免疫酶標(biāo)試劑盒說明書操作:①標(biāo)準(zhǔn)品配制:取標(biāo)準(zhǔn)品1支加500μl標(biāo)準(zhǔn)品液，混勻，全部吸出加入另一支標(biāo)準(zhǔn)品中(A:500 pg/ml)，取1 m l小離心管7支(B、C、D、E、F、G、H)，分別加入250 μl標(biāo)準(zhǔn)品液，H 管為零對照管，從A管吸取250μl加入B管，混勻(B:250 pg/ml)，依次倍比稀釋至 G 管(C:125 pg/ml，D:62.5 pg/m l，E:31.25 pg/ml，F(xiàn):15.6 pg/ml，G:7.8 pg/ml，H:0 pg/m l)。②加樣:樣品孔，每孔加100μl血清;標(biāo)準(zhǔn)品孔，每孔加100μl標(biāo)準(zhǔn)品，均做2復(fù)孔，37℃2 h。③洗板:300μl/孔1×清洗液，甩去，在干凈的吸水紙上拍干。如此洗3遍。④加檢測抗體:100μl/孔，37℃2 h，洗板同③，洗4遍。⑤加酶結(jié)合物:100μl/孔，37℃ 30 min。洗板同③，洗5遍。⑥顯色:顯色液A 50μl/孔，顯色液B 50μl/孔(先加A液再加B液，不得先加B液，也可等量的A液與B液混合，100μl/孔)，37℃ 30 min(從加B液算時間)。⑦終止:終止液100μl/孔，按顯色液加樣順序加樣。⑧測值:測定各孔450 nm的OD值。⑨繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值(pg/ml)為橫坐標(biāo)，以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為縱坐標(biāo)。利用各樣品孔測得的OD值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查相應(yīng)的濃度值，以pg/ml表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用Bartlett法證明各組方差齊性后，采用方差分析和Newman-Keuls-q檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 Western印跡檢測單個核細(xì)胞內(nèi)ERK1/2表達(dá) 各組細(xì)胞內(nèi)均有磷酸化ERK1/2的表達(dá)，F(xiàn)KN組與空白組相比，條帶顏色明顯加深，光密度值增加(1.811 2±0.068 2 vs 0.723 0±0.110 2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PD98059組磷酸化的ERK條帶較FKN組顏色有不同程度變淺，光密度值(1.287 6±0.082 8)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 W estern印跡檢測各組單個核細(xì)胞內(nèi)ERK 1/2表達(dá)

2.2 ELISA法檢測 TNF-α表達(dá)結(jié)果 FKN刺激24 h后，TNF-α 表 達(dá) 〔(206.686 1 ± 7.979 0)pg/m l〕較 空 白 組〔(112.159 6±7.366 2)pg/ml〕增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);應(yīng)用PD98059預(yù)刺激2 h后，再加入FKN孵育24 h組TNF-α 表達(dá)〔(63.894 7±1.577 3)pg/m l〕較FKN 組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

3.1 FKN-CX3CR1對AS的影響及其機制 FKN是新發(fā)現(xiàn)的一種在AS斑塊中過量表達(dá)的趨化因子，在AS形成過程中參與炎癥反應(yīng)，用膜結(jié)合型FKN刺激NK細(xì)胞，或FKN表達(dá)細(xì)胞與NK細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)干擾素 γ(IFN-γ)表達(dá)〔1〕，而且 FKN能與新分離的NK結(jié)合，以劑量依賴的方式增強NK的殺傷力，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔2〕，同時 FKN可以介導(dǎo)表達(dá)其受體CX3CR1的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)等向損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、趨化，并能跨越血管壁向血管外特定部位遷移，F(xiàn)KN還可以促進(jìn)血小板的活化，Barlic等發(fā)現(xiàn)氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和氧化型亞油酸以FKN濃度依賴的方式誘導(dǎo)單核細(xì)胞與冠狀動脈VSMC的異常黏附〔3〕，從而在AS的進(jìn)展中發(fā)揮作用。Ikejima等人發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN-CX3CR1的表達(dá)可能導(dǎo)致冠狀動脈粥樣斑塊的破裂〔4〕。.因此，F(xiàn)KN被認(rèn)為是AS的危險因素之一。經(jīng)實驗證明，趨化因子FKN介導(dǎo)的促白細(xì)胞黏附過程并不需要其他黏附分子，其可通過與受體CX3CR1結(jié)合兼有介導(dǎo)細(xì)胞黏附與趨化的功能〔5，6〕。

目前，還沒有實驗確切證實FKN/CX3CR1系統(tǒng)引發(fā)怎樣的細(xì)胞內(nèi)分子水平反應(yīng)，繼而促進(jìn)AS的形成。TNF對血管內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生直接細(xì)胞毒作用〔7〕，從而破壞內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性，致內(nèi)皮細(xì)胞大片脫落，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞分泌活性物質(zhì)平衡失調(diào)，內(nèi)皮素(ET)合成和釋放增多。通過以上可以看出，TNF-α可能在AS形成中發(fā)揮著很重要的作用。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN處理組TNF-α表達(dá)值較空白組顯著增高。說明FKN可使單個核細(xì)胞TNF-α表達(dá)增加，推測FKN-CX3CR1促進(jìn)AS形成的機制之一可能是通過增加單個核細(xì)胞TNF-α表達(dá)而實現(xiàn)的。

研究表明ERK通路的激活與應(yīng)激刺激、細(xì)菌產(chǎn)物、炎癥介質(zhì)等引起的細(xì)胞反應(yīng)亦存在著密切關(guān)系。ERK分子所涉及的通路在心肌細(xì)胞中具有重要作用，不僅涉及心肌細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、生長等生理過程，與心肌細(xì)胞的肥厚和凋亡等病理過程也密切相關(guān)。Hu等〔8〕發(fā)現(xiàn)，球囊損傷后早期血管組織ERKl/2活性升高，同時伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高;在損傷后7～14 d，內(nèi)膜的 ERK1/2仍然升高，并且內(nèi)膜高于中膜，提示ERK1/2活性和兩種癌基因表達(dá)的增加可能參與了再狹窄過程;Yang等〔9〕報道，ox-LDL在導(dǎo)致培養(yǎng) VSMC增殖的同時，伴隨促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)的活化，并可誘導(dǎo)ERKl/2的活化。可以看出，ERK可能在AS形成中發(fā)揮著很重要的作用。實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN處理組磷酸化ERK1/2含量較空白組顯著增加。結(jié)果說明FKN可使單個核細(xì)胞磷酸化ERK1/2表達(dá)增加，推測FKN-CX3CR1促進(jìn)AS形成的機制之一可能是通過增加單個核細(xì)胞表達(dá)磷酸化ERK1/2而實現(xiàn)的。

3.2 ERK1/2在FKN-CX3CR1影響AS信號傳導(dǎo)機制中的作用 研究證實，CX3CR1屬于G-蛋白耦聯(lián)受體〔10〕。目前國內(nèi)外大量試驗已經(jīng)明確證實:G-蛋白能將與其耦聯(lián)的受體與其相應(yīng)效應(yīng)酶如:蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等聯(lián)結(jié)起來，進(jìn)而通過效應(yīng)酶產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。許多研究表明PKC可以通過 Ras途徑和 PI3K途徑激活 ERK(MAPK)，但 FKNCX3CR1是否可以通過上述途徑，即通過激活PKC而促進(jìn)ERK的活化呢?此前的研究表明，F(xiàn)KN-CX3CR1可以通過G-蛋白與PKC相耦聯(lián)后，誘導(dǎo)單個核細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和TNF-α的表達(dá)〔10〕，從而促進(jìn) AS的形成。以上實驗結(jié)果說明 FKN/CX3CR1-G蛋白-PKC-ERK之間可能存在一系列的級聯(lián)反。

磷酸化激活的ERKl/2可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和功能，影響細(xì)胞產(chǎn)生特定的生物學(xué)效應(yīng)。除此之外，還可以調(diào)節(jié)NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1(Ap-1)等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活化，活化的NF-κB可通過調(diào)節(jié)各種黏附分子、炎性分子及趨化因子而在AS的形成中發(fā)揮作用。本實驗應(yīng)用ERK抑制劑PD98059來阻斷ERK作用，研究探討ERK和TNF-α之間的關(guān)系，也即ERK信號途徑是否參與了FKN誘導(dǎo)引起的單個核細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):PD98059組TNF-α表達(dá)值較FKN組明顯減少。PD98059組與空白組比較，TNF-α的濃度亦明顯減少。結(jié)果說明，ERK在 FKNCX3CR1誘導(dǎo)單個核細(xì)胞表達(dá)TNF-α的過程中發(fā)揮極其重要的作用，阻斷ERK后，TNF-α的濃度明顯減少。結(jié)合此前的實驗研究，推測:FKN-CX3CR1系統(tǒng)可能通過 G-蛋白與效應(yīng)酶PKC偶聯(lián)，活化后的PKC使ERK磷酸化，后者活化后進(jìn)入細(xì)胞核，直接調(diào)節(jié)或者通過影響特定的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB而間接的影響單個核細(xì)胞對TNF-α表達(dá)，最終促進(jìn)AS的形成和發(fā)展。

1 Yoneda O，Imai T，Nishimura M，et al.Membrane-bound form of fractalkine induces IFN-γ production by NK cells〔J〕.Eur J Immunol，2003;33(1):53-8.

2 Yoneda O，Imai T，Gouda S，et al.Fractalkine-mediated endothelial cell injury by NK cells〔J〕.J Immunol，2000;164(8):4055-62.

3 Barlic J，Zhang Y，Murphy PM.Atherogenic lipids induce adhesion of human coronary artery smoothmuscle cells tomacrophages by up-regulating chemokine CX3CL1 on smoothmuscle cells in a TNFα-NFκB-dependent manner〔J〕.JBiol Chem，2007;282(26):19167-76.

4 Ikejima H，Imanishi T，Tsujioka H，et al.Upregulation of fractalkine and its receptor，CX3CR1，is associated with coronary plaque rupture in patientswith unstable angina pectoris〔J〕.Circ J，2010;74(2):337-45.

5 Imai T，Hieshima K，Haskell C，etal.Identification andmolecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1，which mediates both leukocyte migration and adhesion〔J〕.Cell，1997;91(4):521-30.

6 Umehara H，Bollm ET，Okazaki T，et al.Fractalkine and vascular injury［J］.Trends Immunol，2001;22(8):602-7.

7 Schger L，Varahi J，Marks RM，et al.Cytotoxicity of tumor necrosis factorα for human umbilical vein endothelial cells〔J〕.lab Invest，1989;61(11):62-8.

8 Hu Y，Cheng L，Hochleither BW.Activation ofmitogen-activated protein kinases(ERK/JNK)and AP-1 transcription factor in rat carotid arteries after balloon injury〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997;17(11):2808-16.

9 Yang CM，Chiu C，Wang CC，etal.Activation ofmitogen-activated protein kinase by oxidizedlow-denslty lipoprotein in canine cultured vascular smooth muscle cells〔J〕.Cell Signal，2000;12(4):205-14.

10 孫 健，李淑梅，鄭柳穎，等.FKN影響動脈粥樣硬化信號傳導(dǎo)機制及G蛋白在其中作用的研究〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2007;27(6):533-5.

R541.4

A

1005-9202(2011)12-2264-03

吉林省科技發(fā)展計劃項目資助(2007052351)

1 吉林大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科

金元哲(1965-)，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事心臟病介入治療的研究。

雷明明(1982-)，男，碩士，醫(yī)師，主要從事冠心病基礎(chǔ)研究。

〔2011-04-11收稿 2011-04-22修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)