膿毒癥患者CD4+CD25+調節性T細胞檢測的臨床意義

邵 敏，劉 寶，王錦權，陶曉根，周樹生，金 魁，張翠萍

（1.安徽省立醫院 ICU，安徽 合肥 230001；2.安徽省立醫院中心實驗室，安徽 合肥 230001）

膿毒癥患者CD4+CD25+調節性T細胞檢測的臨床意義

邵 敏1，劉 寶1，王錦權1，陶曉根1，周樹生1，金 魁1，張翠萍2

（1.安徽省立醫院 ICU，安徽 合肥 230001；2.安徽省立醫院中心實驗室，安徽 合肥 230001）

目的 探討膿毒癥患者CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）的水平與機體細胞免疫狀態的關系及其檢測的臨床意義。方法將膿毒癥患者40例按照疾病嚴重程度分為3組：膿毒癥組14例，嚴重膿毒癥組15例，膿毒癥休克組11例。所有入選的40例膿毒癥患者在入選當天行流式細胞術檢測血中CD4+CD25+調節性T細胞的比例和CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平。比較膿毒癥組、嚴重膿毒癥組和膿毒癥休克組血中CD4+CD25+調節性T細胞比例變化和CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平變化。同時選取20例健康人為對照組。結果 健康對照組CD4+CD25+調節性T細胞表達率膿毒癥休克組最高，嚴重膿毒癥組次之，膿毒癥組最低，三組間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+較正常對照組明顯升高（P＜0.05）， CD8+較正常對照組差異不明顯（P＞0.05）。嚴重膿毒癥組和膿毒癥休克患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對照組明顯降低（P＜0.05），CD8+較正常對照組改變不明顯（P＞0.05）。結論 膿毒癥患者外周血CD4+CD25+調節性T細胞表達增加，可能導致CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平降低，免疫抑制加強。提示CD4+CD25+調節性T細胞在膿毒癥的免疫發病機制中可能起著重要作用，對評估患者預后有臨床價值。

膿毒癥；細胞免疫；CD4+CD25+調節性T細胞

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應綜合征（systemicinf lammatoryresponsesyndrome，SIRS）。膿毒癥發病機制中，除病原微生物及其毒素直接損害組織細胞外，免疫功能紊亂對其發生發展起重要作用。

CD4+CD25+調節性T細胞（Treg細胞）是近年來新發現的一種負向免疫調節細胞，它可以通過許多途徑影響機體的免疫狀態[1]，抑制炎癥反應。人CD4+CD25+調節性T細胞根據CD25表達數量或熒光強度分為弱、中、強3個等級，目前認為CD25強陽性的CD4+T細胞（CD4+CD25high）能特異性代表人CD4+CD25+T細胞[2]。但目前有關膿毒癥患者CD4+CD25+調節性T細胞（Treg細胞）與CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+等細胞免疫指標變化關系的臨床報道較少[3]。本文就這方面的問題進行了探討。現將試驗結果分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月至2010年11月入住安徽省立醫院ICU的膿毒癥患者40例，疾病構成包括：消化道穿孔破裂術后16例，膽囊壞死及重癥膽管炎9例，腸梗阻術后6例，重癥肺部感染9例。入選患者均符合2001年12月在美國華盛頓召開的國際膿毒癥定義會議所制定的膿毒癥診斷標準[4]，并根據其中的分級標準將患者分為3組：膿毒癥14例，男8例，女6例，年齡（57.1±14.2）歲；嚴重膿毒癥15例，男9例，女6例，年齡（58.1±15.9）歲；膿毒性休克11例，男7例，女4例，年齡（59.4±11.7）歲。排除以下患者：患有自身免疫系統疾病、急性腦卒中、心肌梗塞、病毒性肝炎、HIV感染，入院前3月內使用過激素或免疫抑制劑。選取20例正常人作為健康對照組。

1.2 監測指標

1.2.1 一般監測指標在連續性治療期間監測記錄生命體征、動脈血氣和血乳酸水平變化，評估急性生理和慢性健康評分系統評分（APACHEII評分）[5]。1.2.2 試驗指標

1.2.2.1 試劑和儀器異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD25單抗，藻紅蛋白（PE）標記的CD4單抗和CD25同型陰性對照試劑以及CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS試劑（均購自美國Beckman-Coulter公司）。固定和改變細胞膜滲透性試劑盒（FIX&PERMCellPermeabilizationKit均購自美國eBioscience公司）。流式細胞儀型號為美國Beckman-Coulter公司臨床應用型（EPICS-XLIIMCL），熒光激發光波長為488 nm，分析系統軟件為SystemⅡ系統。

1.2.2.2 標本收集 符合膿毒癥診斷標準的患者于入選當天采肘靜脈血10 mL，4 h內對標本進行處理與檢測。另20例健康者作為對照組同期進行試驗。

1.2.2.3 流式細胞儀檢測CD4+CD25+調節性T細胞和CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+

CD4+CD25+Treg細胞的標記和分析方法參照文獻[6]：首先在試管中加抗凝全血25μL，后分別加入CD25-FITC、CD4-PE單抗各5μL，充分混勻后室溫避光反應15 min，加入500 uL溶血劑，37℃水浴箱放置10 min左右，待完全溶血時立刻上流式細胞儀檢測CD25強陽性的CD4+T細胞（CD4+CD25high）特異性代表人CD4+CD25+T細胞。

T淋巴細胞亞群測定：使用（直接免疫熒光標記法）全血流式細胞儀三色標記法，取100μL全血，肝素抗凝加入20μL熒光標記的CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體，避光反應30 min后，加入0.83%氯化胺（NH4CL）溶血后上機檢測，分析至少5 000個單個核細胞群，確定CD3+、CD4+、CD8+的百分比，計算CD4+/CD8+。

1.3 統計學分析

所有數據用SPSS 13.0統計軟件包進行分析。計量資料用“”表示，作成組t檢驗和單因素方差分析。計數資料作χ2檢驗。在P=0.05的水平上做主要效應的顯著性檢驗。

2 結果

2.1 膿毒癥患者各亞組臨床資料比較

膿毒癥患者三個亞組年齡，性別構成比等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05）。血乳酸水平、APACHEⅡ評分、氧合指數3組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），（表1）。

2.2 膿毒癥亞組與健康對照組間外周血CD4+CD25high表達和CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的

表1 3組病人臨床資料的比較（）

表1 3組病人臨床資料的比較（）

注：aP ＜0.05，vs 膿毒癥組；bP＜0.05，vs 嚴重膿毒癥組；cP ＜0.05，vs膿毒癥組。

組別 n 男/女 年齡（歲） 氧合指數（kPa） APACHE II 血乳酸水平（mmol/L）膿毒癥組 14 8/6 57.1±14.2 36.2±8.0 9.4±2.7 1.6±0.9嚴重膿毒癥組 15 9/6 58.1±15.9 26.5±9.1a 16.6±4.1a 2.6±0.8a膿毒癥休克組 11 7/4 59.4±11.7 14.9±4.7bc 27.1±3.5bc 4.6±0.9bc F（或χ2） 0.108 0.075 23.4 79.5 35.3 P 0.947 0.928 0.00 0.00 0.00

膿毒癥患者CD4+CD25high表達較正常人明顯升高（P＜0.05），膿毒癥休克組CD4+CD25highTreg表達最高（P＜0.05），嚴重膿毒癥組較膿毒癥組升高（P＜0.05）。膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+較正常對照組明顯升高（P＜0.05），CD8+較正常對照組差異不明顯（P＞0.05）。嚴重膿毒癥組和膿毒癥休克患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對照組明顯降低（P＜0.05），CD8+較正常對照組改變不明顯（P＞0.05）（表2）。

2.3 膿毒癥患者CD4+CD25high與APACHEII評分、血乳酸水平和CD4+/CD8+的相關性分析

膿毒癥患者血乳酸水平與APACHEII評分成正相關（r=0.640，P=0.01水平）CD4+CD25high與APACHEII評分成正相關（r=0.829，P=0.01水平）和乳酸水平成正相關（r=0.627，P=0.01）。CD4+CD25high與CD4+/CD8+呈負相關（r=-0.584，P=0.01）。

3 討論

膿毒癥免疫發病機制極其復雜，目前認為促炎反應／抗炎反應動態失衡是膿毒癥進展為嚴重膿毒癥、膿毒性休克和多器官功能不全的（MODS）的原因之一[7]。

T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+均是T細胞重要的表面抗原標志（屬T細胞輔助受體），它們作為免疫效應細胞在直接殺傷靶細胞進行免疫調節等方面發揮著重要的功能。CD3+淋巴細胞為全血T淋巴細胞；CD4+細胞為輔助/誘導T淋巴細胞（Th/Ti），在細胞免疫的效應階段和變態反應中能產生多種淋巴因子，導致炎癥反應，從而加速消除抗原物質；CD8+細胞可對靶細胞產生細胞介導的細胞毒作用，即直接殺傷帶有特異性抗原的細胞或相應的靶細胞，對CD4+細胞具有調節性抑制作用，CD4+/CD8+比值可反映機體的免疫功能狀態[8]，CD4+/CD8+比值降低反映細胞免疫功能的抑制。

表2 膿毒癥亞組與健康對照組間外周血CD4+CD25high和T細胞亞群表達的比較（）

表2 膿毒癥亞組與健康對照組間外周血CD4+CD25high和T細胞亞群表達的比較（）

注：*P＜0.05，vs 正常對照組；# P＜0.05，vs 膿毒癥組；## P＜0.05，vs 嚴重膿毒癥組。

組別 n 年齡（歲） CD4+CD25high（%） CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+ / CD8+正常對照組 20 50.6±10.7 0.39±0.23 65.2±16.7 43.1±9.4 17.5±6.0 2.83±1.28膿毒癥組 14 57.1±14.2 1.72±0.59* 70.3±18.9* 49.4±14.8* 17.2±7.5 3.47±2.06*嚴重膿毒癥組 15 58.1±15.9 2.72±0.22# 45.9±9.6# 26.3±9.4# 17.1±7.5 1.91±1.01#膿毒癥休克組 11 59.4±11.7 3.55±0.51## 36.5±10.1## 20.3±7.0## 16.6±6.7 1.70±0.89##F 1.522 28.58 22.935 22.804 0.939 4.736 P 0.219 0.00 0.00 0.00 0.428 0.005

CD4+CD25+調節性T細胞（Treg細胞）是1995年Sakaguchi等在小鼠體內發現的，在膿毒癥復雜的免疫調節網絡中主要發揮著對細胞免疫的抑制作用。膿毒癥時機體表現為CD4+CD25+調節性T細胞水平持續增高，從而加劇免疫無反應狀態。研究表明膿毒癥患者體內存在過多的Treg細胞，可以通過細胞接觸機制和釋放IL-10、TGF-β等細胞因子誘導淋巴細胞凋亡，下調樹突狀細胞（DC）表面分子CD80／CD86表達，抑制CD4+、CD8+T細胞功能及影響Thl／Th2極化，決定著炎癥反應的不同結局[9]。

本研究通過對膿毒癥、嚴重膿毒癥、膿毒性休克患者細胞免疫的監測，觀察到膿毒癥患者表現為CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對照組明顯升高，CD8+差異不明顯。嚴重膿毒癥組和膿毒癥休克患者表現為：CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對照組明顯降低。CD8+較正常對照組改變不明顯。另外，本研究中膿毒癥休克病人CD4+CD25+調節性T細胞較膿毒癥組和嚴重膿毒癥組明顯升高，嚴重膿毒癥組與膿毒癥組比較是升高的。并且相關性分析表明：CD4+CD25+調節性T細胞與APACHII評分和血乳酸水平成正相關（r=0.829，r=0.627，P=0.01）。與CD4+/CD8+成負相關（r=-0.584，P=0.01）。說明隨病情加重，膿毒癥患者發生細胞免疫低下可能與CD4+CD25+Treg的升高有因果關系，其機制可能是：CD4+CD25+Treg可以通過導致抗炎細胞因子：轉化生長因子β（TGF-β）和IL-10的升高，抑制淋巴細胞的增殖，并誘導高表達FAS和FASL的活化，T淋巴細胞發生FAS-FASL結合，通過Caspase級聯反應，導致T淋巴細胞彼此殺傷或直接“自殺”[10]，使T細胞總數和活化的T細胞數量下降。此外，CD4+CD25+Treg經TCR介導的信號刺激活化后，能抑制CD4+和CD8+T細胞活化和增殖,使Th1向Th2漂移[11]，使免疫亢進轉向免疫抑制。本研究提示隨病情嚴重程度增加，CD4+CD25+調節性T細胞數量增加，導致CD4+、CD4+/CD8+下降，對膿毒癥患者的免疫功能抑制加強，最后導致病人免疫麻痹。在感染和持續升高的前炎癥因子（TNF-α、IL-1β等）等損害下導致病人的高死亡率的發生。

綜上所述，本文詳述了膿毒癥患者CD4+CD25+Treg與T細胞亞群：CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的關系，揭示了CD4+CD25+Treg細胞在膿毒癥患者細胞免疫抑制狀態中的作用。提示臨床檢測膿毒癥患者CD4+CD25+Treg細胞水平可以預測患者的預后。但目前關于CD4+CD25+Treg在膿毒癥中的研究尤其是臨床觀察還很有限，許多確切的調控機制等諸多問題都有待于更深入的探討。隨著CD4+CD25+Treg對機體免疫狀態及調節機制認識的日益深化，許多作用環節都可能成為臨床干預的切入點，從而為防治膿毒癥及其他感染性疾病提供新策略。

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Clinic significance of Testing CD4+CD25+Treg cells in patients with sepsis

SHAO Min, LIU Bao, WANG Jin-quan, TAO Xiao-gen,ZHOU Shu-sheng,JIN Kui,ZHANG Cui-ping
(An Hui Provincial Hospital,He Fei,Anhui 230001,China)

Objective To study the level and significance of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells in peripheral blood of patients with sepsis.Methods 40 patients with sepsis Patients were divided into three groups: sepsis group(n=14), severe sepsis group(n=15), and septic shock group (n=11).The expression of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells of 40 patients on the day 1 was detected by flow cytometry. The comparision in the expression of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells within groups was made. Twenty healthy individuals served as controls.Results The expression rate.The expression of CD4+CD25+Treg cells was the highest in septic shock group(P＜0.05) followed by the severe sepsis group (P＜0.05) and the sepsis group the lowest(P＜0.05).The level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+in sepsis group was higher than control group and the level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+in severe sepsis and sepsis shock was lower than control group.Conclusion The expression of CD4+CD25+Treg cells was increased in sepsis patients and the level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+was low in severe sepsis and sepsis shock patients,suggesting that they may play an important role in pathogenesis of sepsis.Blood Treg% level can reflect the cell immune state of patients with sepsis and is of clinical value to assess the prognosis.

Sepsis;Cell immunity;CD4+CD25+Treg cells

R631

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.003.008.03

2011－01－20

邵 敏（1976－），男，安徽合肥人，在讀博士，主治醫師，主要從事危重癥急救工作。

馬宏宇）