硫酸軟骨素蛋白多糖抑制神經元軸突生長體外生物模型的建立

譚斐，吳曉黎，景良，李桂晨，趙琛，郭陽

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經內科，沈陽 110004）

硫酸軟骨素蛋白多糖抑制神經元軸突生長體外生物模型的建立

譚斐，吳曉黎，景良，李桂晨，趙琛，郭陽

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院神經內科，沈陽 110004）

目的利用硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPG）的生物特性建立抑制神經元生長和軸突再生的體外生物模型。方法 將不同濃度CSPG與無生物毒性的德克薩斯紅熒光染料混合，取5μl滴在培養(yǎng)板的中心部位，形成邊界清楚的紅色圓形斑點，稱CSPG圓斑（CSPG SPOT）。將神經母細胞瘤SY5Y細胞和小鼠小腦顆粒細胞（CGNs）鋪在含有CSPG SPOT的培養(yǎng)板中，48h后觀察細胞的生長情況。結果 含有1μg/ml和3μg/ml CSPG的SPOT分別使CGNs和神經母細胞瘤SY5Y細胞停止生長、死亡，沒有發(fā)現(xiàn)細胞的軸突延伸到SPOT上生長。高濃度的CSPG可滲透到SPOT周圍區(qū)域，使CSPG SPOT周圍區(qū)域的細胞生長和軸突再生受到抑制。結論該模型可以在體外模擬膠質細胞分泌的CSPG對神經細胞生長的抑制作用，對研究中樞神經系統(tǒng)損傷后神經元的生長和軸突的再生具有廣泛的應用前景。

硫酸軟骨素蛋白多糖；細胞生長；軸突延伸；小腦顆粒細胞；神經母細胞瘤細胞

成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)（CNS）軸突損傷后無法再生，可能與CNS髓鞘脂和膠質瘢痕的抑制作用有關。在CNS損傷后，膠質細胞反應性活化、增殖，形成膠質瘢痕。膠質瘢痕及其分泌的以硫酸軟骨素蛋白多糖 （chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGS）為主的大量抑制因子，嚴重阻礙軸突再生［1］。因此改善CNS損傷后的微環(huán)境可能有利于細胞的生長和軸突的再生，從而促進CNS損傷后神經組織及其功能的恢復。CSPGs代表一組復雜的細胞外基質大分子，在哺乳動物的CNS中含量豐富，是由核心蛋白和含有硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）二糖重復單位的糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）組成的蛋白多糖，以跨膜蛋白和分泌蛋白兩種形式存在［2］。研究發(fā)現(xiàn)，CNS損傷后病變周圍區(qū)域CSPGs表達水平升高［3，4］，而 CNS 受損后神經元軸突再生受到抑制與CSPGs的高表達有關［5，6］。目前，對CSPGs引起的神經元軸突抑制機理的研究以及如何阻斷這種抑制作用已成為神經科學研究的熱門課題，這就使得建立有效的體外研究模型成為迫切的需要。本文詳細描述CSPGs圓形斑點的特點和使用，并探討這一體外生物模型的適用性。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

本研究使用具有神經元特性的神經母細胞瘤細胞系—SY5Y細胞和體外培養(yǎng)的原代神經元-新生小鼠小腦顆粒細胞神經元（cerebellar granule neurons，CGNs）進行模型的研究。SY5Y細胞在含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的 RMPI 1640（Sigma-Aldrich公司）培養(yǎng)液中于37℃孵育箱中培養(yǎng)。CGNs首先從活體小鼠中獲得，然后在Neurobasal medium A（Invitrogen-GIBCO公司）培養(yǎng)液中于37℃孵育箱中培養(yǎng)。

1.2 小鼠CGNs的分離與培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)板的處理：24孔塑料培養(yǎng)板，每個孔用無菌鑷放入一個載玻片，然后每個孔再加入50μg/ml的多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine，PLL）200μl，使載玻片浸入PLL液體中。靜置120min后用純蒸餾水沖洗2次，在通風廚中風干后用錫紙包好放4℃冰箱待用。

1.2.2 細胞的分離與培養(yǎng)：小鼠（C57BL/6）CGNs的培養(yǎng)使用以 Levi［7］和 Romero［8］培養(yǎng)方法為基礎的改進方法［9］。取出生后7d的小鼠、斷頭。術者左手持鑷子固定小鼠頭部，右手持剪子從小鼠頭部兩側迅速剪開皮膚和顱骨，然后用彎剪向上掀起小鼠后顱骨，暴露出小腦和部分大腦，用鑷子輕輕剝離整個小腦，每2個小腦放入1個35mm的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿事先盛有2ml冰預冷的Hank’s液。在解剖顯微鏡下仔細分離掉小腦上的軟腦膜和血管。重復上述步驟，直到收集夠實驗所用的小腦。用鑷子把小腦轉移到盛有4ml Hank’s液的培養(yǎng)皿中，再用解剖剪剪碎小腦，加4ml 0.25%Trypsin，輕輕地搖勻，并在37℃水浴箱中孵育10min。之后再加含有10%FBS的培養(yǎng)液5～6ml終止Trypsin的消化作用。轉入15ml細胞培養(yǎng)管，500r/min，離心5min。徹底傾倒上清后加入5ml含有5%DNaseⅠ（1∶20，0.25ml DNaseⅠ 溶在 4.75ml DMEM 液中）的DMEM。用力搖勻并反復吸打使之變成均勻一致的混濁液后經過40μm篩網過濾。500r/min離心過濾液5min。傾倒上清后加入Neurobasal medium A（Invitrogen）培養(yǎng)液（B27+Glutamin+25mmol/L KCL+1%Pen-Strep）2～3ml，用移液器輕輕地吸放，使細胞溶解于培養(yǎng)液中，調整細胞的密度為（3～6）×104/ml，接種入24孔板中。再轉入溫度為37℃，含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 CSPG SPOT的制備

將不同量的CSPG（Sigma公司）與無毒的德克薩斯紅熒光染料（Invitrogen公司）混合配制成不同濃度的 CSPG 混合液，分別是 0，0.5，1.0，3.0，5.0和10μg/ml。取含有不同濃度的 CSPG 混合液 5μl分別滴到事先用PLL覆蓋好的培養(yǎng)板底部的載玻片上，5μl的小液滴形成一個紅色的略帶突起的圓形斑塊，紅色是德克薩斯紅的顏色。室溫下靜置2h，注意保濕，防止5μl的液滴蒸發(fā)。然后用1×PBS液沖洗2遍，風干后備用。這樣，在培養(yǎng)板底部載玻片的中心部位有一邊緣整齊的紅色圓斑（SPOT），沿著SPOT的邊緣形成了一個CSPG/PLL界面。界面內是圓形斑塊，均勻地分布著含有一定濃度的CSPG，界面的外邊是PLL德克薩斯紅的顏色使SPOT與周圍區(qū)域非常容易在熒光顯微鏡下分開。鋪入細胞后，雖然細胞在同一個培養(yǎng)皿中，但處于不同位置的細胞生長環(huán)境不一樣，便于觀察對比。將準備好的SY5Y細胞和制備好的CGNs0.5ml移到含有CSPGSPOT的培養(yǎng)板底部的載玻片上，于37℃孵育箱中培養(yǎng)24h，在顯微鏡下觀察細胞軸突生長情況并拍攝照片。

1.4 細胞免疫熒光染色

（1）細胞準備：將神經細胞接種到預先放置24張6mm×22mm蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，蓋玻片上有事先制備好的CSPG SPOT。待細胞生長成熟和貼壁后，取出蓋玻片，用 1×PBS（0.01mol/L，pH7.4）洗 3次。（2）法固定細胞：用4%多聚甲醛固定液（paraformaldehyde，PFA） 室溫下固定 15min，1×PBS洗3次，吸凈PBS。（3）通透：用0.1%滲透液Triton-100室溫下孵育15min，1×PBS洗3次，每次5min，吸凈PBS。（4）封閉：加入封閉液（5%BSA，以1×PBS稀釋）室溫封閉1h，吸去封閉液。（5）滴加適當稀釋的特異性抗體：一抗：單克隆β III-tubulin抗體（Sigma公司），使用封閉液1∶100稀釋。在室溫下孵育2h。1×PBS洗3次。（6）滴加適當稀釋的熒光素標記抗體，2抗：羊抗鼠-FITC IgG 1∶100（Jackson Immuno Rsearch）在室溫下置于濕盒內孵育45min，1×PBS洗3次。（7）用含有細胞核染色劑DAPI的封片液封片（Vector Laboratories，Inc.），自然晾干后在顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 熒光顯微鏡下SPOT形態(tài)及CGNs生長

制備成的CSPG SPOT肉眼所見是淡紅色圓斑，大小1mm左右。由于SPOT含有德克薩斯熒光染料，在熒光顯微鏡下非常容易發(fā)現(xiàn)和辨認，而視野的其他部分由于不發(fā)光，不能被看到。圖1A和B分別為CSPG SPOT在低倍鏡下所見。圖1C是在高倍鏡下看到的CGNs經β III-tubulin染色后的形態(tài)以及與SPOT的關系，由于該SPOT沒有混合CSPG，CGNs可以在SPOT上生長，細胞的軸突也可以自由穿過CSPG/PLL界面任意地爬行生長，軸突生長方向不受限制。

2.2 顯微鏡下無染色細胞在CSPG SPOT上生長的觀察方法。

圖2A為熒光顯微鏡下所攝的圖片，紅色部分為SPOT，這是鏡下所見SPOT的實際染色。圖2B為在同一視野固定不動的情況下，轉換為光鏡下所攝的圖片。圖2C為圖1A和B經photoshop疊加形成，疊加后SPOT為淺綠色。以下所示各圖均是同一視野下光鏡下和熒光下所拍圖片的疊加，SPOT均為淺綠色。分析疊加后的圖片，可以在同一張圖片上即可看到SPOT又可看到細胞生長情況?？梢詼蚀_，清楚地研究SPOT上細胞生長情況以及SPOT抑制細胞生長及軸突延伸情況。

2.3 CSPG對SY5Y細胞生長的影響

SY5Y細胞是具有神經元特性的神經母細胞瘤細胞系，首先研究不同濃度CSPG對SY5Y細胞生長的影響。如圖3所見，在沒有CSPG（0μg/ml）的條件下SY5Y細胞在整個培養(yǎng)板的底部均勻生長（圖3A）。在添加CSPG的培養(yǎng)皿中，每個條件種植相同數(shù)量的細胞，雖然含0.5μg/ml和1.0μg/ml CSPG SPOT的培養(yǎng)皿中的細胞密度變得較稀疏，但細胞的生長仍比較健康（圖3B，C）。但當CSPG濃度增加至3μg/ml時，可見明顯的以CSPG SPOT邊緣為界限的CSPG SPOT區(qū)域內細胞生長抑制（圖3D），沒有細胞生長。但SPOT周圍區(qū)域的細胞生長正常，細胞突起也不向SPOT內伸展。隨著CSPG濃度的逐漸升高，CSPG周邊部的細胞也受影響，細胞遠離CSPG SPOT生長（圖4E，F(xiàn)）。

2.4 CSPG對小鼠CGNs生長的影響

CSPG對原代神經元小鼠CGNs的影響與對SY5Y細胞生長的影響相似，只是CSPG抑制細胞生長所需的濃度有所不同。如圖4所示，在沒有CSPG（0μg/ml）的條件下，CGNs在整個培養(yǎng)板的底部均勻生長（圖4A），0.5μg/ml CSPG使得CSPG SPOT區(qū)域的細胞生長密度略有降低（圖4B），當CSPG濃度升為1.0μg/ml時，可見明顯的細胞生長停止的邊界：沿著CSPG SPOT的邊緣，CSPT SPOT內細胞不生長，CSPG SOPT外細胞生長，但細胞突起不向SPOT內伸展（圖4C）。但當CSPG濃度升至3.0μg/ml時（圖4D），CSPT SPOT外緣周圍區(qū)域細胞生長也受到限制，這種限制在5.0和10.0μg/ml的濃度時更明顯（圖4E，F(xiàn)）。

3 討論

中樞神經系統(tǒng)受到損傷后會產生反應性膠質增生或膠質瘢痕形成。在膠質瘢痕的形成過程中，膠質細胞分泌一些抑制性分子，主要包括一些CSPGs，這些抑制分子在損傷區(qū)的堆積是抑制軸突生長的重要因素［10］。為了研究CSPG阻斷神經元軸突生長的機制，我們制作CSPG SPOT模擬體內神經元損傷后病變區(qū)CSPG升高的病理生理環(huán)境。首先在細胞培養(yǎng)皿的底部覆蓋一層PLL，PLL是由多種細胞分泌的存在于細胞基質中對細胞起著支持、保護、連結和營養(yǎng)作用的一種物質，這個過程相當于模擬神經細胞正常生存的基質環(huán)境。然后在其上加入5μl含有CSPG的液體，這個小液滴由于重力和張力作用形成大約直徑1mm的圓形區(qū)域，這個區(qū)域相當于神經損傷病變區(qū)，含有CSPG。由于CSPG液體本身沒有顏色，即使在顯微鏡下也不能確定這個模擬神經病變區(qū)的位置所在。所以我們在配制CSPG的液體中加入無生物毒性的熒光染料。這樣我們就可以在熒光顯微鏡下區(qū)分病變區(qū)和非病變區(qū)，研究神經生長與CSPG抑制作用之間的關系。CSPG和PLL的交界區(qū)，我們稱為CSPG/PLL界面，界面的一邊主要含有CSPG，界面的另一邊僅含有PLL。細胞的軸突如果能夠穿過這一區(qū)域，細胞就可以在CSPG上生長，即在病損區(qū)生長，是判定CSPG濃度是否抑制細胞生長的分界線。

我們發(fā)現(xiàn)在最低的4倍物鏡下可以看到整個5μl的液滴形成的SPOT，但無法觀察細胞生長情況。20倍物鏡下可以看到細胞生長被抑制的起止點，但無法細致地觀察細胞生長情況。在63倍的物鏡下，細胞體以及細胞軸突生長和生長方向非常清楚，有利于研究病變區(qū)細胞形態(tài)變化和生長情況。

腫瘤細胞能夠自給自足地獲得生長信號，具有頑強的生長和分裂的能力。而原代神經元培養(yǎng)所需的條件較高，對周圍環(huán)境改變極其敏感。所以我們分別選擇具有神經元特性的神經母細胞瘤細胞系—SY5Y和CGNs神經元，研究抑制細胞生長的模型對他們的影響及發(fā)現(xiàn)抑制這兩種細胞生長的最適合濃度。我們發(fā)現(xiàn)引起細胞生長抑制的CSPG濃度在不同細胞中不同，如在SY5Y細胞中需要3μg/ml達到明顯的生長抑制，而在CGNs中僅需要1μg/ml。同時我們觀察到，小鼠CGNs對CSPG的變化更敏感，3μg/ml CSPG濃度可使SPOT周圍區(qū)域的細胞生長受到抑制，而在SY5Y細胞，直到5μg/ml的濃度，SPOT周圍區(qū)域細胞生長才開始受到抑制，10μg/ml對SPOT周圍的抑制更加明顯。這一結果提示，在具體的實驗研究中，應根據所使用的細胞種類的不同選擇相應的適宜濃度，甚至實驗目的不同，CSPG應使用的濃度也會不同。以本實驗結果為例，如果研究某種治療方法對軸突生長的促進作用，那么對于小鼠CGNs我們選擇1μg/ml，對SY5Y細胞我們選擇3μg/ml。這兩個濃度引起的細胞突起生長抑制剛好是沿著CSPG SPOT邊緣，而不累及SPOT周圍區(qū)域。如果使用藥物抵消CSPG的作用，細胞可能重新在SPOT上生長，軸突可能又延伸至CSPG SPOT內，我們將在今后的研究中深入探討。

雖然CSPG引起神經元突起生長抑制已比較肯定，但CSPG的作用機理還不明確，最近有報道Rho/ROCK通路可能參與了CSPGs的信號轉導［11］，目前Rho/ROCK通路被認為是調節(jié)與突起生長有關的骨架肌動蛋白的一條重要信號轉導通路，許多軸突生長抑制分子都是通過激活該通路發(fā)揮效應的。這提示在損傷局部直接降解CSPGs，或者抑制與CSPGs有關的細胞內信號轉導，對于CNS損傷后的軸突再生都可能有促進作用。利用本研究方法建立的模型，可以在原位通過免疫染色的方法，觀察細胞與CSPG接觸后細胞內信號通路的變化，同時可以研究在針對CSPG給予相應的處理條件后神經元軸突的生長變化情況。所以這一模型對研究CNS損傷后神經元軸突的生長和神經元的再生具有廣泛的應用前景。

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（編輯裘孝琦，英文編輯陳 姜）

An in vitro Model of Chondroitin Sulfate Proteoglycan-induced Axon Outgrowth Inhibition

TAN Fei，WU Xiao-li，JING Liang，LI Gui-chen，ZHAO Chen，GUO Yang
（Department of Neurology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo establish an in vitro model to study the inhibitory effect of chondroitin sulfate proteoglycan（CSPG）on neuronal growth and axonal regeneration.MethodsDifferent concentrations of CSPG were mixed with Texas-red Dye which has no biological toxicity，and 5μl of the mixture was dropped onto the center of the bottom of culture plates to form red round spots，which was called CSPG spots.SY5Y neuroblastoma cells or cerebellar granule neuron （CGN）from mice were seeded on the plates and cultured for 48hours.The cell growth and axon extension were observed under microscope.ResultsIn CSPG spots containing 1and 3μg/ml of CSPG，the growth of CGNs and SY5Y neuroblastoma cells were inhibited，and cell death occurred in the spot areas.No axon extension was found in cells outside the CSPG spots.High concentration of CSPG in the spots inhibited the growth of cells around CSPG spots.ConclusionThis model mimics the CSGP-induced axon outgrowth inhibition，which can be used to study the neuronal growth and axonal regeneration after central nervous system injury.

chondroitin sulfate proteoglycan；cell growth；axon extension；cerebellar granule neuron；neuroblastoma cell

R338.1

A

0258-4646（2011）01-0004-05

遼寧省科技廳社發(fā)基金資助項目（2009225010-12）

譚斐（1966-），男，副教授，碩士.E-mail：tanf@sj-hospital.org

2010-10-05