CDH12對涎腺腺樣囊性癌細胞侵襲能力的影響

王錦鋒，佘林，于林燦，鄭斐斐，盧友光

（福建醫科大學附屬口腔醫院預防科，福州 350002）

CDH12對涎腺腺樣囊性癌細胞侵襲能力的影響

王錦鋒，佘林，于林燦，鄭斐斐，盧友光

（福建醫科大學附屬口腔醫院預防科，福州 350002）

目的探討CDH12基因對涎腺腺樣囊性癌細胞（SACC）侵襲能力的影響。方法 應用巢式RT-PCR法從涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株SACC-M的總RNA中擴增出CDH12cDNA；應用AdEasyTMXL腺病毒載體系統構建含人CDH12基因的重組腺病毒表達載體；轉染SACC-M細胞后，采用Western blot檢測CDH12蛋白分子的表達，采用侵襲小室法檢測CDH12對SACC-M細胞侵襲能力的影響。結果 CDH12基因重組腺病毒及空腺病毒經鑒定正確；Western blot檢測發現，CDH12基因重組腺病毒轉染細胞（Ad-CDH12/SACC-M）組CDH12的表達水平明顯高于空腺病毒載體轉染（Ad0/SACC-M）對照組；與Ad0/SACC-M組相比，Ad-CDH12/SACC-M組細胞的侵襲能力明顯高于Ad0/SACC-M組（P＜0.01）。結論CDH12能夠促進涎腺腺樣囊性癌細胞的體外侵襲能力，提示該基因在涎腺腺樣囊性癌的侵襲轉移中可能具有重要意義。

CDH12；腺病毒；腺樣囊性癌；侵襲

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是最常見的唾液腺惡性腫瘤之一，容易侵襲神經或侵入血管并擴散，通過血行轉移至肺是SACC的臨床生物學特征之一。CDH12基因編碼的神經型鈣黏素（N-cadherin）分子是鈣黏素分子家族的重要成員，目前已在多種人類腫瘤中檢測到了N-cadherin的異常表達［1］。我們在前期研究中構建了轉移能力不同的兩個SACC細胞株的基因表達譜［2］，在此基礎上篩選出可能與轉移相關的cadherin家族基因，并應用實時定量PCR技術及免疫組化技術檢測了SACC高低轉移細胞株之間cadherin基因相對表達水平的差異，發現CDH12基因在SACC高低轉移細胞株之間的表達水平有明顯差異［3］。這說明CDH12基因可能在SACC的侵襲轉移中起重要的作用。本研究通過構建CDH12基因重組腺病毒表達載體，觀察其對涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株SACC-M侵襲能力的影響，以期進一步研究CDH12與涎腺腺樣囊性癌侵襲轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞

人涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株SACC-M由上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面外科腫瘤實驗室惠贈，SACC-M是利用人涎腺腺樣囊性癌低轉移細胞株SACC-2［4］5次連續裸鼠體內傳代，結合體外克隆技術，篩選出的肺高轉移性腺樣囊性癌細胞株［5］，其轉移能力與SACC-2相比有明顯的增強，轉移率由18%提高至96%。腺病毒包裝細胞AD-293由福建醫科大學分子醫學研究中心、福建省高校感染與腫瘤重點實驗室提供。SACC-M以及AD-293細胞均培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱培養。

1.2 質粒、菌株及主要試劑

腺病毒穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1、E.coli DH5α、BJ5183-AD-1和XL 10-Gold菌株購自美國Stratagene公司；DMEM培養基、胰酶和胎牛血清（FBS） 購自美國 HyClone 公司；TRIzol、Lipofectine 2000購自美國 Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNA Ligation Kit Ver.2.0、pMDTM18-T Vector 購 自 日 本TaKaRa寶生物公司；膠回收及質粒小量抽提試劑盒購自上海超世生物科技有限公司；質粒大量抽提試劑盒購自德國Qiagen公司；限制性核酸內切酶NheⅠ、XhoⅠ、PmeⅠ和PacⅠ等購自美國NEB公司；兔抗人-CDH12抗體購自英國Abcam公司；細胞裂解液、BCA法定量試劑及AP標記山羊抗兔二抗購自上海碧云天生物技術公司；PVDF膜購自美國Amersham公司；CDP-STAR購自瑞士Roche公司；Fibronectin、BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber為美國BD公司產品；其余化學試劑為國產分析純。

1.3 引物設計與合成

PCR引物（表1）根據GenBank登錄的CDH12基因序列（NM_004061）用primer 3.0程序設計，其中內引物的上游引物含有NheⅠ酶切位點（下劃線斜體所標示序列），下游引物含有XhoⅠ酶切位點（下劃線斜體所標示序列），設計完成后由上海博尚生物技術有限公司合成。

表1C D H 12巢式P C R引物T a b.1P r i me r s u s e d f o r n e s t e d P C R Primer Sequence of primers PCR product size（bp）Outer-primer Forward 5′ACGGTTGATTTGACGGATTTCT 3′ 2762Reverse 5′CTTGTCCCAGAGTGTGTGTGTG 3′Inter-primer Forward 5′CTAGCTAGCATGCTTACAAGGAACTGTTT 3′ 2403Reverse 5′CCGCTCGAGAGTGACTTTATCAGGGTTAT 3′

1.4 CDH12基因的擴增、克隆、篩選和鑒定

取處于對數生長期的SACC-M細胞，采用TRI－zol試劑提取細胞總RNA，電泳確認RNA未被降解后，用紫外可見分光光度計測定樣品吸光度（A260及 A280）。取 0.5μg RNA，利用 PrimeScript RT reagent Kit進行RT-PCR，按照37℃15min；85℃2min；4℃10min合成cDNA；然后按照PrimeSTAR HS DNA Polymerase說明書進行巢式PCR擴增CDH12基因，并在CDH12基因兩端引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位點。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離回收后，與pMD18-T vector于4℃進行連接，16h 后轉化 E.coliDH5α 感受態菌，轉化后（50μg/ml）氨芐青霉素抗性瓊脂平板上隨機挑選單克隆，PCR篩選重組子，EcoRⅠ酶切鑒定重組質粒。將經過PCR篩選和酶切鑒定正確的pMD18T-CDH12陽性重組子的菌液送往上海英駿生物技術有限公司作基因序列檢測。經測序正確的克隆命名為pMD18TCDH12。用于篩選陽性克隆的PCR引物序列為：上游 5′CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3′，下游 5′GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3′。

1.5 CDH12基因重組腺病毒載體的構建

將測序正確的克隆pMD18T-CDH12與腺病毒穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1分別經NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后用DNA Ligation Kit連接，轉化E.coli DH5α感受態菌后，抽提質粒行NheⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。鑒定正確后，將其轉化BJ5183感受態菌，用50μg/ml卡那霉素LB瓊脂平板篩選，PacⅠ酶切鑒定，陽性重組子轉化XL 10-Gold感受態菌，Pac I酶切鑒定，大量抽提鑒定正確的重組腺病毒質粒（pAd-CDH12）及空腺病毒質粒（pAd0），定量后經PacⅠ消化及純化，以Lipofectamine 2000轉染AD-293細胞，轉染10～14d后可見AD-293細胞發生細胞病變效應（cytopathic effect，CPE），熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達。繼續擴增腺病毒2代，并測定腺病毒的滴度，獲得最適感染復數（multiplicity of infection，MOI）。

1.6 CDH12基因重組腺病毒表達載體的鑒定

將Ad-CDH12及Ad0分別以MOI感染SACCM細胞，3d后收集細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白，BCA蛋白定量后，利用Western blot驗證CDH12重組腺病毒載體的表達。即分別取15μg細胞總蛋白進行SDS-PAGE電泳后，電轉移至PVDF膜，0.5%BSA封閉，依次結合兔抗人-CDH12單克隆抗體（一抗）、AP標記山羊抗兔IgG（二抗）后，用CDP-Star作為堿性磷酸酶的化學發光底物，暗室中X線片曝光、顯影，掃描。以tubulin作為內參蛋白。

1.7 體外腫瘤細胞侵襲能力的測定

在已包被好Matrigel的BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber內外加入500μl無血清DMEM培養基，置于37℃、5%CO2培養箱中2～3h。胰酶消化分別感染Ad-CDH12及Ad015h后的SACC-M細胞，重懸于無血清DMEM培養液，向小室內分別加入1.5×105個上述2組細胞。下室內加入700μl含0.1mg/ml Fibronectin和10%FBS的DMEM培養液，置37℃、5%CO2培養箱常規培養48h。取出小室，棄除上室液體，室溫下結晶紫染色，用棉簽擦凈上室膜面未穿膜的細胞，光鏡下（×200）計數5個視野的侵襲細胞數，計算平均值，每組重復3次。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 目的基因CDH12的獲得

采用RT-PCR從SACC-M細胞提取總RNA，經巢式PCR擴增獲得目的基因CDH12，并在CDH12基因兩端引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位點。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在約2.7kb處可見1明亮條帶，與目的片段大小一致（圖1）。目的基因與T載體連接后，經測序證實與GenBank登錄的人CDH12基因序列一致。

2.2 CDH12重組腺病毒表達載體的鑒定

測序正確的重組子pMD18T-CDH12經NheⅠ和XhoⅠ雙酶切后，將CDH12亞克隆至腺病毒穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1，然后經Pme I線性化后轉化BJ5183感受態菌，在BJ5183中與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1發生同源重組，PacⅠ酶切鑒定獲得正確的腺病毒質粒（圖2），將其轉化XL 10-Gold感受態菌大量擴增，腺病毒質粒pAd-CDH12及pAd0轉染AD-293細胞后會發生CPE，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白（圖3），說明CDH12基因重組腺病毒Ad-CDH12及空腺病毒Ad0包裝成功。

2.3 Western blot鑒定N-cadherin的表達

Western blot檢測結果顯示，感染Ad-CDH12和Ad0的SACC-M細胞裂解物中均可見到140kDa左右的N-cadherin帶。感染Ad-CDH12組表達水平比（N-cadherin/tubulin）明顯高于感染空腺病毒載體的Ad0組，說明腺病毒載體能很好地表達CDH12蛋白。見圖4。

2.4 CDH12對SACC-M細胞侵襲能力的影響

BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber已經重建了基底膜膠，在聚碳酸脂膜表面形成類似天然基底膜的結構，細胞侵襲穿過重建基底膜膠的能力可反映該細胞的侵襲能力。Ad-CDH12/SACC-M組48h后穿過侵襲小室聚碳酸脂膜的細胞數（88.00±9.70）明顯多于 Ad0/SACC-M 組（42.80±4.92）（P ＜0.01），說明Ad-CDH12/SACC-M細胞的侵襲能力明顯增強。見圖5。

3 討論

鈣黏素是鈣離子依賴性的親同性細胞黏附分子，主要參與正常組織結構的形成和維持，使細胞具有不同的黏附特性；也可作為信號受體，參與影響細胞的增殖和分化等生物學行為，而且可能在腫瘤形成、侵襲和轉移過程中發揮著至關重要的作用。目前已經發現＞110個鈣黏素家族成員，其中包括經典鈣黏素分子，如上皮型鈣黏素（E-cadherin，由CDH1基因編碼）、神經型鈣黏素（N-cadherin，由CDH12基因編碼）等。Zhang等［6］研究發現，E-cadherin在SACC中低表達，且其表達水平同SACC細胞的分化呈正相關。此外，Lai等［7］認為，E-cadherin 的表達同SACC的神經侵襲、局部復發和遠處轉移有關。本課題組前期構建了SACC轉移能力不同的兩個細胞株的基因表達譜［2］，在此基礎上篩選出可能與轉移相關的cadherin家族基因，并在應用實時定量PCR技術檢測涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞株SACC-M與低轉移細胞株SACC-2之間cadherin基因相對表達水平的差異時發現，CDH12基因在SACC-M中的表達水平明顯高于SACC-2，免疫組化檢測結果發現，CDH12在有轉移的臨床標本中的表達高于沒有轉移的標本［3］。提示CDH12基因可能在SACC的侵襲轉移中起重要作用。在本研究中，我們通過構建CDH12基因重組腺病毒并感染SACC-M細胞使其過表達CDH12蛋白（N-cadherin分子），體外細胞侵襲實驗顯示，CDH12可以促進SACC細胞的體外侵襲能力。進一步證實了CDH12基因在SACC細胞中的異常表達影響其侵襲能力，CDH12可以促進SACC的侵襲能力，因此推測CDH12在SACC的惡性進展中可能起著重要的作用。

研究發現，N-cadherin可通過促進腫瘤細胞的遷移，在上皮性腫瘤的侵襲轉移過程中起決定性作用，而且在乳腺癌、甲狀腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都檢測到了N-cadherin的異常表達［1］。Islam 等［8］發現，上皮細胞不適當的表達N-cadherin會引起細胞間更多的分離，這是侵襲性腫瘤細胞的典型特征。此外，N-cadherin還可能通過與內皮細胞的相互作用來促進腫瘤的轉移。研究發現，與對照組相比，經轉染后表達N-cadherin的乳腺癌細胞MCF-7與人單層內皮細胞之間的黏附力明顯增強［9］。另有研究發現，N-cadherin在促進黑色素瘤的發生中起著雙重作用。正常黑色素細胞通過E-cadherin與角化細胞的相互作用調節其生長，當黑色素細胞在黑色素瘤演進過程中從表達E-cadherin轉為表達N-cadherin時，解除了角化細胞對生長的控制，獲得了同成纖維細胞和內皮細胞相互作用的能力，而這兩種細胞均表達N-cadherin。黑色素瘤細胞同真皮成纖維細胞的相互作用可使其遷移出組織，同內皮細胞的相互作用則可使其進入循環系統［10，11］。

cadherin屬于Ⅰ型細胞表面膜蛋白，其表達隨著細胞生長、發育狀態不同而改變，并且可以作為信號受體，影響細胞的增殖和分化等生物學行為，在細胞極性、分選和遷移方面均具有調節作用。研究發現，N-cadherin能夠促進成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）啟動一種非生長因子依賴性的信號通路［12，13］，也可以激活 FGF 受體依賴的信號通路［14］。而生長因子受體可以調節多種細胞行為，包括細胞的運動性和侵襲性［15］。研究還發現，N-cadherin也可能同腫瘤細胞其他受體酪氨酸激酶相互作用，例如一種稱為鈉氫交換子調節因子的小蛋白作為骨架把N-cadherin和β-catenin同血小板源性生長因子受體連接起來，這種蛋白質復合體定位于遷移的腫瘤細胞的前沿，可促進腫瘤細胞的運動［16］。結合本研究結果，我們認為，CDH12可能促進SACC細胞的體外侵襲能力，因此推測CDH12在SACC的惡性進展中可能起著相當重要的作用。但癌細胞的侵襲轉移是一個復雜的過程，涉及到多種基因或信號的變化，CDH12基因可能不是唯一影響SACC侵襲和轉移的重要因素，其影響SACC侵襲轉移的具體機制仍有待于進一步深入研究。

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（編輯王又冬，英文編輯鄭華川）

Effect ofCDH12on the Invasive Ability of Salivary Adenoid Cystic Carcinoma Cells

WANG Jin-feng，SHE Lin，DING Lin-can，ZHENG Fei-fei，LU You-guang
（Department of Preventive Dentistry，Hospital of Stomatology，Fujian Medical University，Fuzhou 350002，China）

ObjectiveTo clarify the effect of geneCDH12on invasiveness of human salivary adenoid cystic carcinoma cells.MethodsCDH12cDNA was amplified by nested RT-PCR using the total RNA extracted from the highly metastatic human salivary adenoid cystic carcinoma cell line SACC-M.TheCDH12gene recombinant adenoviral expressing vector was constructed using AdEasyTMXL Adenoviral Vector System.SACC-M cells were infected with recombinant adenovirus and the expressed target proteins were examined by Western blot.Tumor invasion assay was performed to study the effect ofCDH12on invasiveness of SACC-M cells.ResultsTheCDH12gene recombinant and control adenoviral expressing vector were successfully constructed.The expression ofCDH12was significantly increased in Ad-CDH12/SACCM cells compared with that in Ad0/SACC-M cells.Compared with Ad0/SACC-M cells，the invasive ability of Ad-CDH12/SACC-M cells had been enhanced significantly.ConclusionCDH12could increase the invasion of salivary adenoid cystic carcinoma cells in vitro.CDH12might have an important role in the invasion and metastasis of salivary adenoid cystic carcinoma.

CDH12；adenovirus；adenoid cystic carcinoma；invasion

R781.7

A

0258-4646（2011）01-0033-05

福建省科技廳科技計劃重點項目（2008Y0041）

王錦鋒（1983-），男，醫師，碩士.

盧友光，E-mail：fjlyg63@163.com

2010-06-30

book=1,ebook=173