SELDI篩選絨癌耐氨甲喋呤細胞株耐藥相關蛋白

楊曉丹，李巨

（1.遼寧醫學院附屬第一醫院婦產科，遼寧 錦州 121001；2.沈陽軍區第202醫院婦產科，沈陽 130001）

SELDI篩選絨癌耐氨甲喋呤細胞株耐藥相關蛋白

楊曉丹1，李巨2

（1.遼寧醫學院附屬第一醫院婦產科，遼寧 錦州 121001；2.沈陽軍區第202醫院婦產科，沈陽 130001）

目的應用飛行時間質譜技術結合蛋白芯片分析篩選人絨毛癌細胞株JAR及其與人絨毛癌耐氨甲喋呤細胞株JAR/MTX之間的蛋白質表達差異，尋找出絨癌耐藥的相關蛋白。方法 采用體外細胞培養來提取兩種細胞的胞漿蛋白和分泌蛋白，應用SELDI-TOF-MS技術檢測各細胞株提取的胞漿蛋白和分泌蛋白，采用CM-10型弱陽離子交換芯片檢測。結果 經SELDI技術檢測發現質荷比（m/z）為8132.043，10738.36的胞漿蛋白在JAR/MTX細胞中呈高表達；質荷比（m/z）為11555.09的分泌蛋白及m/z為4896.68的胞漿蛋白在JAR細胞中高表達，在JAR/MTX中呈低表達。結論應用飛行時間質譜技術結合弱陽離子交換芯片，可有效篩選絨癌耐氨甲喋呤細胞株中的特異性表達蛋白；尋找到的差異蛋白與絨癌耐藥密切相關，并可能成為本病耐藥的標志物。

滋養細胞腫瘤；JAR細胞株；JAR/MTX細胞株；蛋白芯片；差異蛋白；飛行時間質譜；表面增強激光解吸離子化

妊娠滋養細胞腫瘤（gestational trophoblastic tumour，GTT）是一組來源于胎盤滋養細胞的腫瘤，它類似于腫瘤細胞，有增殖、分化、侵襲的特點。由于其獨特的組織學來源和生物學行為以及對化療的敏感性，絨癌已成為最早可以治愈的實體腫瘤。然而對于耐藥患者的治療效果卻難以令人滿意而成為治療的難題，從而需要不斷探索本病出現耐藥的機理及新的治療方法以解決這類病人的耐藥問題。

目前臨床上關于腫瘤耐藥的檢查手段具有自限性和滯后性，蛋白質組學［1］高靈敏度和特異性的分析技術有助于捕獲腫瘤演變過程中細微的分子變化，使之成為診斷和監測腫瘤演進的重要線索，特別是差異蛋白組織學問世，人們應用SELD-TOF-MS技術表面加強的激光解析/電離化時間—飛行質譜儀結合配套的蛋白質芯片技術［2］，已經篩選出了乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等十余種腫瘤的血清特異性蛋白質。本研究通過檢測人絨癌細胞株JAR和耐藥細胞株JAR/MTX兩種細胞株的蛋白質指紋圖譜，以尋找與人絨癌耐藥密切相關的蛋白，進一步探討絨癌耐藥的原因，并為深入研究絨癌耐藥的標志物提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細胞株JAR/MTX購于浙江醫科大學附屬婦產科醫院；人絨毛膜癌細胞株JAR購于美國ATCC公司。

1.1.2 主要試劑及儀器：胎牛血清，RPMI-1640培養液購于美國HyCLone公司，U9（9mol/L Urea，2%CHAPS），乙晴，三氟乙酸，白芥子酸（SPA），尿素，4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），HPLC水等均購于美國Sigma公司的色譜級產品，蛋白提取試劑盒及BCA蛋白含量檢測試劑盒購于南京凱基生物公司，蛋白質芯片時間質譜飛行儀（PBSIIC）及其CM-10型弱陽離子交換芯片購于美國Ciphergen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養復蘇液氮凍存JAR及JAR/MTX細胞株，常規培養含10%的胎牛血清、RPMI1640培養液中，置37℃、5%CO2培養箱飽和濕度下傳代培養。

1.2.2 細胞分泌蛋白的提取：待兩種細胞生長率為90%左右，PBS沖洗細胞3次，更換不含胎牛血清的RPMI-1640培養基繼續培養24h。離心管收集同種細胞培養基，超濾離心濃縮，置于-80℃保存。

1.2.3 細胞胞漿蛋白的提取：按10～14μl/cm2加入細胞裂解液，冰上孵育30min，收集同種細胞裂解液，10000r/min低溫離心30min，取上清分裝，置于-80℃保存。

1.2.4 CM-10型蛋白芯片操作步驟：樣品冰上融解后，10000r/min，4℃，離心2min。取96孔板細胞培養板，放冰盒上；取出芯片，裝入生物芯片處理器，在芯片上加 10μl U9，每孔分別再加 5μl樣品，600r/min4℃，振蕩 30min；加 200μl 50mmol/L pH 4.0NaAC，用力拍干。加 200μl NaAC 600r/min 5min 3次（常溫）。每孔加入200μl HPLC水，迅速甩干。待芯片表面自然晾干后，各點加SPA0.5μL，重復一次后用蛋白芯片閱讀機進行蛋白質譜的檢測分析。

1.2.5 數據采集和結果分析：采用CM-10型蛋白芯片機進行檢測篩選，并用PBSIIC型蛋白芯片閱讀機讀取芯片的信息，儀器參數設置為：初始激光強度190，檢測敏感度 7，質荷比（m/z）為 Mr2000～20000的蛋白峰。由于受金屬離子及基質的影響本研究將m/z小于2500的基質峰排除。采用美國Ciphergen Protein Software 3.2.0版本的分析軟件生成的數據，然后用 Biommarker Wizard軟件分析 JAR，JAR/MTX，兩組間峰值差異P值。

2 結果

2.1 人絨毛膜癌細胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細胞株（JAR/MTX）之間分泌蛋白的差異性表達

應用CM-10型蛋白芯片檢測人絨毛膜癌細胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細胞株（JAR/MTX）所提取的分泌蛋白，并采用Biommarker Wizard軟件分析后顯示，兩組間的蛋白圖譜存在差異蛋白峰，其m/z為11555的蛋白在JAR中呈高表達，在 JAR/MTX 中呈低表達（P＜0.05）（圖 1）。

2.2 人絨毛膜癌細胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細胞株（JAR/MTX）之間胞漿蛋白的差異性

應用CM-10型蛋白芯片檢測人絨毛膜癌細胞株（JAR）與人絨毛膜癌耐氨甲喋呤細胞株（JAR/MTX）所提取的胞漿蛋白，采用Biommarker Wizard軟件分析后顯示，兩組間的蛋白圖譜存在3個差異蛋白峰，m/z分別為8132，10738在JAR/MTX中呈高表達，4896在JAR中高表達（P＜0.05）（圖2）。

3 討論

研究表明，腫瘤的發生早期就可在蛋白水平發生結構上重要的改變，腫瘤的發生發展過程中，有許多不同功能性的蛋白參與其中，蛋白表達異常不僅包括了蛋白量表達的增多或減少，還有蛋白加工翻譯后的改變，這些都可能影響到腫瘤的發展過程及生物學行為。SELDI-TOF-MS根據蛋白質芯片表面不同的修飾M特性，選擇性地捕獲樣品中與之特異性結合的蛋白，具有簡單、快速、敏感、高通量、粗樣本和上樣量少的特點［2］。本實驗利用此技術檢測了絨癌細胞株JAR與絨癌耐氨甲喋呤細胞株JAR/MTX的蛋白質圖譜，CM-10型芯片利用它弱陽離子的特性，其表面有弱陰離子羧基，可以與被分析物表面的正電荷集團相互作用而捕獲正電荷蛋白［3］。為了保證實驗結果的可靠性，每種細胞收獲3次，以排出組間差別；每份樣品在同種芯片3個以上不同點進行檢測，以排除不同芯片間點之間的差異。通過比較蛋白質譜發現，在兩種細胞株中有4個蛋白質峰有明顯變化。

從以上實驗結果可以看出，在提取的胞漿蛋白中人絨癌耐氨甲喋呤JAR/MTX的細胞株中Mr 8132，10738蛋白表達明顯升高，而4896在JAR細胞中呈高表達。表明JAR/MTX細胞株出現耐藥可能與8132，10738蛋白的升高有關。當然，上述篩選出的差異蛋白還需要從相應的血清和組織標本中進一步證實和鑒定。

體外培養的細胞株雖然不能完全反應體內細胞的生長狀態和生物學活性，但它具有成分單一、均質性好、實驗條件容易控制等優點。尤其在做對比性研究時可避免有組織細胞成分復雜，細胞異質性高等缺點造成的結果不真實和不可靠［4］。我們培養了JAR，JAR/MTX細胞，裂解細胞蛋白后，SELDI-TOFMS分析蛋白表達的差異。絨癌在發生，發展過程中其細胞內的蛋白質變化可以反映到血清中，可從體外培養的絨癌細胞株中篩選出部分與癌癥病人血清中相一致的標志蛋白，這部分蛋白可能就是與耐藥的發生密切相關的功能蛋白或調節蛋白。

蛋白質芯片技術目前已廣泛用于臨床各種疾病的研究中，已經篩選出了乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等十余種腫瘤的血清特異性蛋白質［5］，目前對絨癌耐藥方面相關研究甚少，而關于本病耐藥特異蛋白的研究除本課題組的報告外未見其他報道。由于該技術的應用成本相對較高，對技術的掌握和熟練程度還需提高。小分子量蛋白質的檢測仍然沒有像大分子量蛋白質檢測那么容易，質譜檢測出的蛋白質不能直接鑒定，必須通過后續的檢測方法判斷蛋白質的種類，這些都限制了該技術在臨床領域大規模的運用［6］。

［1］Lim JY，Cho JY，Paik YH，et al.Diagnost-ic application of serum proteomic patterns in gastric cancer patients by proteinchip surfaceenhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry［J］.Int J Biol Markers，2007，22（4）：281-286.

［2］MerchantM，Weinberger SR.Recent advancements in surface enhanced laser desorp tion/ionization time of flight mass spectrometry［J］.Ctrophoresis，2000，21（6）：1164-1771.

［3］Xu WH，Chen YD，Hu Y，et al.Preoperatively molecular staging with CM10ProteinChip and SELDI-TOF-MS for colorectal cancer patients［J］.Zhejiang Univ Sci B，2006，7（3）：235-240.

［4］夏梁，蔡偉麗，張麗麗，等.體外培養的不同亞型肺癌細胞株差異蛋白的初步分析［J］.現代儀器，2004，1：13-17.

［5］Issaq HJ，Conrads TP，Prieto DA，et al.SELDITOF MS for diagnostic proteomics［J］.Anal Chem，2003，75（7）：148A-155A.

［6］KasK.Onthetechnicalitiesofdiscoveringandapplyingproteinbiomarkers for cancer prevention［J］.Eur J Cancer Prevention，2004，13（5）：437-446.

（編輯孫憲民，英文編輯鄭華川）

Screening Resistance-related Protein in JAR/MTX Cell Line by SELDI

YANG Xiao-dan1，LI Ju2
（1.Department of Obsterics and Gynecology，The First Affiliated Hoppital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，China；2.Department of Obsterics and Gynecology，No.202Hospital of the Chinese People′s Liberation Army，Shenyang 110003，China）

ObjectiveThis study aimed to analyze the differences between the human placenta cancer cell line JAR and the methotrexateresistant JAR/MTX and screen out the drug resistance-associated proteins in the choriocarcinoma.MethodsThe protein was extracted from culture cell and to examine the cytoplasmic and secreted proteins using the surface-enhanced laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry（SELDI-TOF-MS）.This cell lines were tested using CM-10weak cation exchanging protein chip.ResultsThe cytosolic proteins with mass charge ratio（m/z）of 8132.043，10738.36in the cytoplasmic protein was highly expressed in JAR/MTX cells.The secreted protein with mass charge ratio （m/z）of 11555.09and the cytolosic protein with the mass charge ratio（m/z）of the 4896.68was highly expressed in JAR cells，but lowly in JAR/MTX cells.ConclusionThe combination of the time of flight mass spectrometry technology with a weak cation exchanging protein chip might effectively screen specific proteins of MTX-resistant choriocarcinoma cell line and explore the relation between protein expression and drug resistance in the choriocarcinoma.

gestational trophoblastic tumour；protein chip；differentially expressed protein；time of flight-mass spectrometry；surface-enhanced laser desorption and ionization

R73-35+1；R730.231

A

0258-4646（2011）01-0045-03

楊曉丹（1983-），女，碩士.

李巨，E-mail：lxz3110@163.com

2010-04-01