非小細(xì)胞肺癌中抑癌基因PTEN表達(dá)、突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性研究

舒紅，張洪蘭，馬穎，姜衛(wèi)國

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004；2.連云港市第一人民醫(yī)院病理科，連云港 222000）

非小細(xì)胞肺癌中抑癌基因PTEN表達(dá)、突變與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的相關(guān)性研究

舒紅1，張洪蘭2，馬穎1，姜衛(wèi)國1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004；2.連云港市第一人民醫(yī)院病理科，連云港 222000）

目的通過檢測非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中PTEN基因的表達(dá)及突變，進(jìn)一步闡明PTEN基因與NSCLC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。方法 收集有完整隨訪資料的61例NSCLC蠟塊，用免疫組化SP法檢測PTEN蛋白的表達(dá)；選擇其中30例癌組織蠟塊提取DNA，PCR擴(kuò)增PTEN基因第3、5、7、8外顯子，并進(jìn)行DNA測序。結(jié)果 PTEN蛋白表達(dá)在NSCLC組織中低于癌旁正常組織；并隨著臨床分期的增加及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而降低；PTEN蛋白陽性組的生存期明顯高于陰性組，而與年齡及腫瘤的分化程度無關(guān)。僅1例標(biāo)本發(fā)生了PTEN基因外顯子5、7、8的純和性丟失，2例發(fā)現(xiàn)了2類突變位點(diǎn)的存在，這2類突變均位于內(nèi)含子中。結(jié)論P(yáng)TEN蛋白的表達(dá)水平下調(diào)在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中可能起了重要作用；而PTEN基因的改變比率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其蛋白表達(dá)下調(diào)的程度。

非小細(xì)胞肺癌；PTEN基因；基因突變；蛋白表達(dá)

肺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素參與的復(fù)雜過程。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen，PTEN）突變和蛋白表達(dá)異常與多種惡性腫瘤有關(guān)［1］。然而該基因與非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的確切關(guān)系各家報(bào)道不一［2，3］。本研究通過觀察PTEN蛋白在NSCLC中表達(dá)及PTEN基因的突變情況，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)PTEN基因在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 臨床病理資料

收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科存檔的NSCLC石蠟標(biāo)本61例作為實(shí)驗(yàn)組，取距腫瘤5cm以上的正常肺組織20例作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組中男46例，女15例，年齡30～77歲，中位年齡60歲，術(shù)前均未接受放化療。按組織類型劃分，腺癌22例，鱗癌36例，腺鱗癌3例。其中Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期16例。所有病例均有完整的隨訪數(shù)據(jù)，其中30例存活，3例復(fù)發(fā)，28例病故，隨訪時(shí)間2.5～10年。

1.2 主要試劑與設(shè)備

PCR反應(yīng)試劑盒及PCR擴(kuò)增儀均為TaKaRa公司；兔抗人PTEN多克隆抗體為美國SANTA CRUZ公司產(chǎn)品；引物序列由上海Introgen公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化SP法檢測NSCLC中PTEN蛋白表達(dá)：石蠟切片脫蠟后，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，高壓鍋加熱進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加一抗，濕盒中4℃過夜。滴加二抗，37℃孵育30min，DAB顯色。

1.3.2 石蠟包埋組織DNA提取：由于NSCLC組織標(biāo)本存在壞死，我們選取了其中30例質(zhì)量較好的標(biāo)本，各年齡段、臨床分期及生存期情況近似于全體的各部分組成比。石蠟切片10μm/片×20片，經(jīng)脫蠟后加入蛋白酶K消化，酚/氯仿/異戊醇法提取DNA。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成：PTEN 基因第 3、5、7、8外顯子引物設(shè)計(jì)采用gene tool 1.0軟件設(shè)計(jì)（表1）。

表1P T E N基因第3、5、7、8外顯子P C R擴(kuò)增引物序列及退火溫度T a b.1P r i me r s e q u e n c e o f e x o n 3，5，7，a n d 8o fP T E Ng e n e a n d a n n e a l i n g t e mp e r a t u r e PTENexon Primer sequence Fragment Annealing temperature Exon3 upstream： 5′GTAATTTCAAATGTTAGCTCA3′ 149bp 56℃downstream：5′GAAGATATTTGCAAGCATACA3′Exon5 upstream： 5′CCTGTTAAGTTTGTATGCAACA3′ 338bp 59℃downstream：5′TCCAGGAAGAGGAAAGGAAA3′Exon7 upstream： 5′TGACAGTTTGACAGTTAAAGG3′ 347bp 58℃downstream：5′AACACCTGCAGATCTAATAGAA3′Exon8 upstream： 5′CTCAGATTGCCTTATAATAGTC3′ 558bp 59℃downstream：5′TCATGTTACTGCTACGTAAAC3′

1.3.4 PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應(yīng)總體系為50μl，含模板DNA 1μl（300～400ng）。反應(yīng)條件為94℃5min，40個(gè)循環(huán)，94℃持續(xù)1min，退火持續(xù)1min，72℃持續(xù)1min，最后1次循環(huán)結(jié)束后，于72℃繼續(xù)延伸10min。取5μlPCR產(chǎn)物反應(yīng)液加入1/5體積的6×Loadingbuffer，進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.5 PCR產(chǎn)物DNA序列測定：由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行產(chǎn)物純化及DNA序列測定。

1.3.6 免疫組化結(jié)果判定：參照文獻(xiàn)［1］，根據(jù)顯色細(xì)胞的比例及染色強(qiáng)度分別計(jì)1～3分，兩項(xiàng)乘積≥3分為陽性。

1.3.7 基因突變判定：（1）外顯子純和性丟失判定：以β-actin為內(nèi)參，在凝膠電泳中不出現(xiàn)目的擴(kuò)增條帶，則判定為某個(gè)外顯子的純合性丟失；（2）點(diǎn)突變判定：在DNA測序圖中，舍棄測序開始的30個(gè)左右的堿基，基線較平的峰圖中出現(xiàn)套峰，且對(duì)照NCBI基因序列出現(xiàn)堿基改變時(shí)，判定為突變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并用Log-rank檢驗(yàn)。用SPSS13.0的統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

PTEN蛋白陽性表達(dá)在NSCLC組織中為49.2%（30/61），在正常對(duì)照組中為 95.0%（19/20），二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

PTEN蛋白表達(dá)在肺腺癌明顯高于肺鱗癌（χ2=8.86，P＜0.05）；PTEN 蛋白表達(dá)與臨床分期（χ2=5.074）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=5.003）呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；而與年齡（χ2=3.599）及分化程度（χ2=0.807）無關(guān)（P ＞0.05）。

2.2 NSCLC組織中PTEN表達(dá)與患者術(shù)后生存期的關(guān)系

用Kaplan-Meier生存分析顯示，PTEN表達(dá)（-）組患者平均生存期為36.462個(gè)月，中位生存期為22.000個(gè)月；PTEN表達(dá)（+）組患者平均生存期為70.982個(gè)月，中位生存期為90.000個(gè)月，患者術(shù)后生存率與PTEN的表達(dá)呈正相關(guān)（Log-rank檢驗(yàn)P＜0.05），見圖 1。

2.3 NSCLC 中 PTEN 基因外顯子 3、5、7、8的突變情況

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后顯示PTEN基因4個(gè)外顯子片段，其中外顯子5、7、8各有1例（圖2中12、15泳道。外顯子7圖略）未出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物（以β-actin作為內(nèi)參），而這3個(gè)外顯子屬于同一個(gè)患者，說明該患者出現(xiàn)了PTEN基因外顯子5、7、8的純和性缺失。

PCR產(chǎn)物經(jīng)測序檢測出2類2個(gè)突變位點(diǎn)的存在。這2類突變均位于內(nèi)含子中，包括在第7外顯子 3'側(cè)翼下游 46bp處檢測到 1個(gè) G→A（116033）點(diǎn)突變（圖3）和在第8外顯子5'側(cè)翼上游2bp和3bp之間插入了1個(gè)T（圖4）。

2.4 NSCLC組織PTEN基因改變與其臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系

3例PTEN基因改變的NSCLC患者均為晚期；其中2例為鱗癌且為中低分化腫瘤；3例術(shù)后生存期都不足1年。提示臨床分期越晚、病理分級(jí)越差術(shù)后生存期短的NSCLC患者易于發(fā)生PTEN基因的突變。

3 討論

PTEN［5］定位于染色體 10q23.3，有 9個(gè)外顯子。它是具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因，其缺失、突變、表達(dá)產(chǎn)物的失活等均可影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6］。

目前有關(guān)PTEN蛋白表達(dá)與肺癌關(guān)系的研究結(jié)論不太一致［2，3］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，NSCLC 組織中PTEN蛋白陽性表達(dá)明顯低于癌旁正常肺組織；Ⅰ、Ⅱ期組高于Ⅲ、Ⅳ期組；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明PTEN基因的低表達(dá)參與了NSCLC的發(fā)生，并促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。肺腺癌中PTEN蛋白表達(dá)明顯高于鱗癌，說明PTEN蛋白的丟失在鱗癌中的作用可能高于腺癌。Kaplan-Meier生存曲線證實(shí)PTEN蛋白陽性表達(dá)組的生存率明顯高于陰性組。PTEN蛋白表達(dá)與NSCLC年齡及分化程度無關(guān)。

PTEN基因最常見的突變發(fā)生于外顯子5、7和8［7］。本研究選取 PTEN 基因的第 3、5、7、8外顯子（跨部分內(nèi)含子）進(jìn)行PCR擴(kuò)增及DNA測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅1例標(biāo)本（男性，68歲，低分化鱗癌，臨床Ⅳ期，術(shù)后生存12個(gè)月）發(fā)生了PTEN基因外顯子5、7、8的純合性丟失，提示臨床晚期、分化程度低、發(fā)生淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移且生存期較短的NSCLC患者容易發(fā)生PTEN基因的純合性丟失。DNA測序發(fā)現(xiàn)了2類2例突變位點(diǎn)的存在。這2類突變均位于內(nèi)含子中，根據(jù)目前的文獻(xiàn)分析，我們所發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)均為首次報(bào)道，鑒于2例均為內(nèi)含子的點(diǎn)突變，推測這些突變?cè)赑TEN基因的選擇性剪切和轉(zhuǎn)錄過程中可能起了一定作用。本研究表明PTEN基因改變?cè)贜SCLC中是少見的，合計(jì)突變率為10.0%，純合性丟失率為3.33%。Ferraro等［8］報(bào)道，NSCLC中PTEN的突變率僅為6%～8%，而PTENDNA純合性丟失在肺癌細(xì)胞系中卻占8%～40%。因本研究未對(duì)PTEN基因的全部外顯子及內(nèi)含子進(jìn)行檢測，故可能低估了PTEN基因在NSCLC中的突變率。

本研究與以往的研究結(jié)果類似，腫瘤組織中PTEN蛋白表達(dá)減少明顯高于PTEN基因純合或雜合性缺失及基因突變的比率。這一現(xiàn)象表明除基因水平異常外，基因轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯水平后修飾等基因各階段異常導(dǎo)致的PTEN蛋白表達(dá)及功能異常更為重要［9］。鑒于蛋白質(zhì)是執(zhí)行生物學(xué)功能的基本單位，基因的突變最終要通過蛋白質(zhì)的改變來實(shí)現(xiàn)，因此PTEN蛋白的表達(dá)情況對(duì)NSCLC的影響似乎比其突變與缺失更有說服力。

［1］Zhang Y，Yu D，Li X，et al.Reduced expression of PTEN protein and its prognostic significance in the gastrointestinal stromal tumor［J］.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2010，30（2）：165-169.

［2］Bepler G，Sharma S，Cantor A，et a1.RRM1and PTEN as prognostic parameters for overall and disease-free survival in patients with non small cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2004，22（10）：1878.

［3］張尚福，蘇學(xué)英，謝斌，等.肺癌中PTEN蛋白的表達(dá)［J］.中華病理學(xué)雜志，2000，29（3）：220-221.

［4］Freitas S，Moore DH，Michael H，et al.Studies of apurinic/apyrimidinic endonueclease/ref-1expression in epithelial ovarian cancer：correlations with tumor progression and platinum resistance［J］.Clin Cancer Res，2003，9（13）：4689-4694.

［5］Li J，Yen C，Liaw D，et al.PTEN a putive protein tyrosine phoshatage gene mutated in human brain，breast and prostate cancer ［J］.Science，1997，275（5308）：1943-1947.

［6］Grill C，Guelly C，Ebner B，et al.Loss of PTEN/MMAC1activity is a rare and late event in the pathogenesis of nephroblastomas［J］.Human Pathology，2010，41（8）1172-1177.

［7］Ali IU，Schriml LM，Dean M.Mutational spectra of PTEN/MMAC1gene：a tumor suppressor with lipid phosphatase activity［J］.J Natl Cancer Inst，1999，91（22）∶1922-1932.

［8］Ferraro B，Bepler G，Sharma S，et al.EGR1predicts PTEN and survival in patients with non-small cell lung cancer ［J］.Clin Oncol，2005，23（9）：1921-1926.

［9］Erkanli S，Kayaselcuk F，Kuscu E，et al.Expression of surviving，PTENandp27innormal，hyperplastic，andcarcinomatousendometrium［J］.Int J Gynecol Cancer，2006，16（3）：1412-1418.

（編輯武玉欣，英文編輯鄭華川）

PTENMutation and Expression in Non-Small Cell Lung Cancer

SHU Hong1，ZHANG Hong-lan2，MA Ying1，JIANG Wei-guo1
（1.Department of Pathology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Pathology，Lianyungang First People’s Hospital，Lianyungang 222000，China）

ObjectiveTo clarify the relationship betweenPTENand the tumorigenesis，progression or prognosis of non-small cell lung cancer（NSCLC）.MethodsExpression of PTEN was examined in 61cases of NSCLC and 20cases of normal lung tissue by SP immunohistochemistry.Exon 3，5，7，9ofPTENgene were evaluated by PCR and sequencing.ResultsPTENexpression was lower in NSCLC than in control.PTENexpression was correlated with lymph node metastasis，clinical stage and overall survival，but not with patient’s age，sex and histological grading.One of 30cases showed loss of homozygosity ofPTENexon 5，7and 8in NSCLC and 2showed mutations ofPTEN.ConclusionDown-regulation of PTEN protein might be involved in the development of NSCLC pathogenesis.However，the genetic alterations ofPTENwere infrequent.

non small cell lung cancer；PTENgene；mutation；protein expression

R734.2

A

0258-4646（2011）01-0070-04

舒紅（1967-），女，副教授，博士.E-mail：shuhong0302@hotmail.com

2010-11-15