血管內皮生長因子調節成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達

趙恒伍，張錦程，李長有

（中國醫科大學附屬第一醫院骨科，沈陽 110001）

血管內皮生長因子調節成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達

趙恒伍，張錦程，李長有

（中國醫科大學附屬第一醫院骨科，沈陽 110001）

目的探討血管內皮生長因子（VEGF）對大鼠成骨細胞Ihh和p38MAPK的調節作用。方法 取胎鼠顱蓋骨分離培養成骨細胞，采用實時PCR檢測成骨細胞中Ihh及其受體Ptch1和p38MAPK的表達，檢測成骨細胞在不同濃度（0，2，20ng/ml）及不同時間（0，12，24h）的VEGF作用下Ihh和p38MAPK的表達情況。結果 成骨細胞表達Ihh及其受體Ptch1，同時表達p38MAPK。隨著VEGF濃度的增加，Ihh和p38MAPK的表達量均明顯增加；隨著VEGF作用時間的增加，Ihh和p38MAPK的表達量與對照組相比有明顯的增長趨勢。結論Ihh與其受體Ptch1在成骨細胞中共表達，Ihh以自分泌方式調節成骨細胞功能；VEGF上調成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達，并且VEGF可能通過調節p38MAPK的表達而影響Ihh的表達，可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh通路。

成骨細胞；大鼠；Ihh；血管內皮生長因子

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作為血源性因子具有調節成骨細胞的功能。Hedgehog（Hh）蛋白家族包括3個成員：Sonic Hedgehog（Shh）、Indian Hedgehog（Ihh） 和 Dersert Hedgehog（Dhh）。其中，Shh和Ihh作為重要的信號分子，在肢體發育過程中起關鍵調控作用。研究發現，Ihh影響成骨細胞的發育［1］。p38絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路在成骨細胞增殖、分化中有重要意義［2］。本研究對VEGF是否可以調節成骨細胞中Ihh和p38MAPK的表達進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：新生SD大鼠胎鼠，清潔級，由中國醫科大學實驗動物中心提供。

1.1.2 藥品和試劑：鼠重組VEGF蛋白（美國Pepro－Tech公司），α-MEM培養基（美國Gibco公司），I型膠原酶（美國Sigma公司），堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物工程研究所），茜素紅（中國醫科大學解剖教研室惠贈），Trizol、實時PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 成骨細胞培養：出生24h內的大鼠，切下顱蓋骨，用剪刀將骨組織剪碎，0.5%Ⅰ型膠原酶5ml 37℃預消化20min，棄消化液，0.5%Ⅱ型膠原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，將骨片再次0.5%Ⅱ型膠原酶5ml 37℃消化20min，移取消化液，如此反復4次，將移取的消化液1000r/min離心10min，棄上清，加入培養液適量；混勻消化的細胞，以1.2×104/cm2接種于 25cm2培養瓶，置 5%CO2、37℃條件下培養。

1.2.2 實驗分組：第4代成骨細胞達80%融合時，用含1%胎牛血清的α-MEM培養基同步化后隨機分為：（1）正常對照組：只加1%胎牛血清的α-MEM培養；（2）VEGF 組：不同濃度（0，2，20ng/ml）及不同時間（0，12，24h）的 VEGF 培養。

1.2.3 實時PCR檢測IhhmRNA、Ptch1mRNA和p38MAPKmRNA的表達：Trizol提取總細胞RNA，逆轉錄合成cDNA。Ihh上游引物為5′-TGCCTCCGT CCTCTGCT-3′，下游引物為 5′-CACTACCTGGTCAA GTCTCAAA-3′；Ptch1上游引物為 5′-TCCTGATTGC GTCTGTTG-3′，下游引物為 5′-AGCCCTGTGGTTCT TGTC-3′；p38MAPK 上游引物為 5′-AGACCGTTTCA GTCCATCA-3′，下游引物為 5′-TCACATTCTCGTGC TTCAT-3′；內參照 GAPDH，上游引物為 5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。PCR 反應條件為 95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，45個循環。反應結束后，采用PCR儀（Gene 6000）軟件進行分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 成骨細胞培養鑒定

成骨細胞在生長過程中表現出均一的短梭形或三角形，培養一段時間后細胞呈鋪路石樣改變，經ALP染色胞質呈黑紫色（圖1A，B）。含β硝酸甘油的培養基培養2周，可見鈣結節形成，經茜素紅染色呈磚紅色結節（圖1C）。

2.2 成骨細胞中Ihh、Ptch1和p38MAPKmRNA的表達

PCR結果顯示，成骨細胞中Ihh及其受體Ptch1mRNA清晰表達，p38MAPKmRNA也清晰表達（圖2）。

2.3 VEGF調節成骨細胞中Ihh和p38MAPKmRNA的表達

在不同濃度（0，2，20ng/ml）VEGF 作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表達量均隨VEGF濃度的增加而增多，在20ng/ml VEGF作用下Ihh和p38MAPKmRNA的表達量分別約為無VEGF作用時的2.6倍（圖3A）和4.7倍（圖3B）；在同一劑量（20ng/ml）VEGF的作用下，Ihh和p38MAPKmRNA的表達量隨作用時間的延長而增多，在24h時Ihh和p38MAPKmRNA的表達量分別約為0h的2.8倍（圖4A）和 2.9倍（圖 4B）；無 VEGF作用時，Ihh和 p38MAPKmRNA的表達量隨時間延長均無明顯變化（圖4）。

3 討論

Ihh是一種分泌型蛋白，屬于Hedgehog信號家族，是果蠅節段性極性基因Hedgehog在脊椎動物體內的同源物，主要表達于哺乳動物肥大軟骨細胞，與胚胎發育過程中骨骼的形成密切相關。Ptch1是Ihh信號通路受體細胞上的受體蛋白及下游目標基因，為一類12通道的跨膜蛋白，當Ihh蛋白與Ptch1結合后，誘導一系列下游信號分子的釋放，發揮其調控作用［3］。本研究發現，成骨細胞中Ihh及其受體Ptch1同時表達。近年研究發現Ihh參與調節胚胎發育的軟骨內成骨過程，其主要作用是影響軟骨細胞的終末分化，調節成骨細胞分化［4］。體外實驗證實，Ihh可促進成骨細胞分化。干預Ihh信號（Ihh缺如、抑制Ihh受體Ptch1）發現，鼠的骨領和初級骨小梁都未形成［5，6］。這些都說明了Ihh與其受體Ptch1結合調節成骨細胞功能。本研究證實Ihh及其受體Ptch1可在成骨細胞合成，通過自分泌方式調節成骨細胞功能。

MAPK屬絲氨酸蘇氨酸激酶，是一類分布于胞質中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶。MAPK信號轉導途徑是細胞外信號引起細胞核內反應的通道之一，可參與細胞的形成、運動、凋亡、分化及生長增殖等多種生理過程［7］。p38MAPK途徑是MAPK信號轉導途徑的通道之一，是成骨細胞增殖分化調節的重要信號通路之一［8］。本研究也證實了p38MAPK在成骨細胞是有表達的。

本研究還證實，VEGF促進成骨細胞中Ihh的表達，同時也可促進p38MAPK的表達。VEGF作用下，Ihh和p38MAPK的表達量與VEGF存在劑量依賴性和時間依賴性；隨著VEGF劑量加大、VEGF作用時間的延長，Ihh和p38MAPK的表達量增加。Kim等［9］在成骨樣細胞的研究中發現，VEGF對p38MAPK有調節作用，這與我們研究的結果一致。但關于VEGF是否具有調節Ihh作用的文獻報道很少。Li等［10］發現，骨髓間充質干細胞中Ihh的表達通過p38MAPK途徑，p38MAPK的表達增加可促進Ihh的表達增加。由此推斷，成骨細胞中VEGF可能通過促進p38MAPK的表達促進Ihh的表達。本研究證實，VEGF可促進Ihh的表達，VEGF作用下p38MAPK的表達與Ihh的表達有相關性。通過本研究發現，VEGF可調節p38MAPK和Ihh，提示可能存在VEGF-p38MAPK-Ihh調節通路。

［1］Kesper DA，Didt-Koziel L，Vortkamp A.Gli2activator function in preosteoblasts is sufficient to mediate Ihh-dependent ssteoblast differentiation，whereas the repressor function of Gli2is dispensable for endochondral ossification［J］.Dev Dyn，2010，239（6）：1818-1826.

［2］Parreno J，Hart DA.Molecular and mechano-biology of collagen gel contraction mediated by human MG-63cells：involvement of specific intracellular signaling pathways and the cytoskeleton ［J］.Biochem Cell Biol，2009，87（6）：895-904.

［3］Zunich SM，Douglas T，Valdovinos M，et al.Paracrine sonic hedgehog signalling by prostate cancer cells induces osteoblast differentiation［J］.Mol Cancer，2009，2（8）：1-12.

［4］Burdan F，Szumixo J，Korobowicz A，et al.Morphology and physiology of the epiphyseal growth plate ［J］.Folia Histochem Cytobiol，2009，47（1）：5-16.

［5］Guo S，Zhou J，Gao B，et al.Missense mutations in Ihh impair Indian Hedgehog signaling in C3H10T1/2cells：implications for brachydactyly type A1，and new targets for Hedgehog signaling［J］.Cell Mol Biol Lett，2010，15（1）：153-176.

［6］Ruiz-Perez VL，Blair HJ，Rodriguez-Andres ME，et al.Evc is a positive mediator of Ihh-regulated bone growth that localises at the base of chondrocyte cilia［J］.Development，2007，134（16）：2903-2912.

［7］Séverin S，Ghevaert C，Mazharian A.The mitogen-activated protein kinase signaling pathways：role in megakaryocyte differentiation［J］.J Thromb Haemost，2010，8（1）：17-26.

［8］Gaundar SS，Bendall LJ.The potential and limitations of p38MAPK as a drug target for the treatment of hematological malignancies［J］.Curr Drug Targets，2010，11（7）：823-833.

［9］Kim IS，Song JK，Song YM，et al.Novel effect of biphasic electric current on in vitro osteogenesis and cytokine production in human mesenchymal stromal cells［J］.Tissue Eng Part A，2009，15（9）：2411-2422.

［10］LiJ，ZhaoZ，YangJ，etal.p38MAPKmediatedincompressive stressinduced chondrogenesis of rat bone marrow MSCs in 3D alginate scaffolds［J］.Cell Physiol，2009，221（3）：609-617.

（編輯陳 姜，英文編輯王又冬）

Effect of Vascular Endothelial Growth Factor on the Expressions ofIhhandp38MARKin Osteoblasts

ZHAO Heng-wu，ZHANG Jin-cheng，LI Chang-you
（Department of Orthopedics，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the effect of vascular endothelial growth factor （VEGF）on the expressions of Indian hedgehog（Ihh）and p38mitogen-activated protein kinase （MAPK）in osteoblasts.MethodsThe osteoblasts from the calvarial of neonatal rats were cultured and treated with different concentrations （0，2，and 20ng/ml）of VEGF for various durations （0，12，and 24hours）.The expressions levels ofIhhand its receptorPtch1andp38MAPKin the osteoblasts were determined with real-time polymerase chain reaction.ResultsIhh，Ptch1，andp38MAPKexpression were observed in the osteoblasts.With the increase of the concentration of VEGF，the expressions levels ofIhhandp38MAPKsignificantly increased.Compared with control group，the expresions ofIhhandp38MAPKtended to increase with the prolongation of the duration of VEGF treatemnt.ConclusionIhhandPtch1were coexpressed in the osteoblasts.Ihhregulates the osteoblasts in an autocrine manner.VEGF might upregulates the expressions ofIhhby regulatingp38MAPKexpression.VEGF-p38MAPK-Ihh pathway might exist in the osteoblasts.

osteoblast；rat；indian hedgehog；vascular endothelial growth factor

R593.22

A

0258-4646（2011）02-0113-04

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0950.004

遼寧省自然科學基金資助項目（20092119）

趙恒伍（1985-），男，碩士研究生.

李長有，E-mail：cyli@mail.cmu.edu.cn

2010-11-23