肺炎支原體23SrRNA基因突變及其所致肺炎的臨床分析

韓曉華，路素坤，李書秀，劉立云，陳寧，李書琴

（中國醫科大學附屬盛京醫院小兒呼吸科，沈陽 110004）

肺炎支原體23SrRNA基因突變及其所致肺炎的臨床分析

韓曉華，路素坤，李書秀，劉立云，陳寧，李書琴

（中國醫科大學附屬盛京醫院小兒呼吸科，沈陽 110004）

目的了解肺炎支原體23SrRNA基因突變現狀，提高對肺炎支原體大環內酯類抗生素耐藥基因突變所致肺炎的臨床認識和診治水平。方法 對2009年5月至2009年10月我院住院的肺炎支原體肺炎患兒咽試子標本，應用巢式PCR擴增23SrRNA基因并進行電泳檢測及DNA測序分析，篩選突變株；并進行總結和分析臨床特點。結果 應用巢式PCR擴增23SrRNA測出基因序列45例，均存在大環內酯類抗生素耐藥基因突變。且變異基因位點均為2063位A→G的點突變，其中2例為2063位點A/G雙峰；臨床特點表現為91.1%患兒持續性發熱伴咳嗽，以中、高度熱為主。68.9%外周血白細胞總數正常；45例患兒肺部影像資料顯示，雙肺炎癥14例，大葉性肺炎7例，伴胸腔積液6例。20例有肺外合并癥；45例應用紅霉素靜注治療有效率91.1%。結論肺炎支原體大環內酯類抗生素作用位點之一23SrRNA2063普遍存在突變，其所致肺炎的臨床表現無特異性；應用大環內酯類抗生素治療91.1%有效，肺炎支原體此位點突變與其在體內是否耐藥尚需進一步研究。

肺炎支原體肺炎；23SrRNA基因突變；臨床表現；耐藥性

近年來不斷有肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）耐藥基因突變的報道。日、中、法、美、德等國家均有研究發現，臨床分離株中出現大環內酯類抗生素作用靶位23SrRNA的2063或/和2064位點突變，并在體外藥敏試驗中證實基因突變MP對大環內酯類抗生素耐藥［1～6］。隨著MP耐藥基因突變的報道日益增多，突變MP所致肺炎在臨床患兒有何表現及其治療等問題已引起廣大臨床醫生的關注。本文對我院確診為肺炎支原體肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）患兒 52例，采集咽試子標本行23SrRNA基因電泳檢測及DNA測序，分析突變株基因狀況，對突變MP所致肺炎的患兒臨床資料進行分析，旨在提高對MP耐藥基因突變所致肺炎的認識，觀察大環內酯類抗生素治療MP耐藥基因突變肺炎臨床療效。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2009年5 月至10月于中國醫科大學附屬盛京醫院小兒呼吸病房住院的肺炎患兒180例，確診為MPP患兒52例，其中45例咽拭子標本測出23Sr－RNA基因序列。男26例，女19例（男∶女=1.37∶1）；年齡為 6個月～12歲，平均年齡（4.67+3.33）歲。其中6個月～3歲15例，4歲～5歲14例，6歲～12歲16例。

1.2 診斷標準與方法

1.2.1 肺炎支原體肺炎診斷標準：小兒肺炎均符合《諸福棠實用兒科學》第7版診斷標準［7］，MP感染的診斷標準為：應用熒光探針定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術進行MP-DNA鑒定陽性，同時用顆粒凝集（particle agglutination，PA）方法檢測血清肺炎支原體抗體，MP-Ab≥1∶160或對比2次采血抗體滴度增高4倍以上為陽性。

1.2.2 標本采集及儀器、試劑：在患兒入院當天用無菌生理鹽水浸濕的無菌咽拭子適度用力擦拭患兒咽后壁，置于低溫保存，用于FQ-PCR檢測MP-DNA。同時采靜脈血l ml低溫保存，用于測定MP抗體（MP-Ab）。

SLAN熒光定量分析儀（上海宏石公司），MP核酸檢測試劑盒（PCR－熒光探針法）購于上海復星醫學科技發展有限公司，巢式PCR試劑購于大連寶生物有限公司，肺炎支原體抗體診斷試劑盒（凝膠顆粒法檢測MP-Ab），Serodia MycoⅡ試劑盒。

1.2.3 巢式PCR擴增23SrRNA基因并進行電泳檢測及DNA測序分析：以熒光定量PCR及MP抗體均為陽性的標本為模板，進行巢式PCR檢測，對于其第2次擴增終產物經純化后作雙脫氧末端終止法全自動DNA測序（純化和測序由南京金斯瑞生物技術公司ABI3730XL型測序儀完成），測得序列與美國國立生物信息中心（NCBI）檢索的MP-23SrRNA基因序列作比對尋找突變位點。

1.2.4 其他檢查：45例患兒均送檢血、尿、便常規、ASO、C反應蛋白、肝腎功能、心肌酶譜及血清病毒IgM抗體（呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、EB病毒、腺病毒、艾柯病毒、柯薩奇病毒），全部患兒均行X線胸片或肺CT檢查。

1.3 療效判斷標準

治愈：臨床癥狀完全消失，肺部影像示陰影基本消失；好轉：臨床癥狀消失，肺部影像示炎癥病灶大部分吸收；無效：僅用大環內酯類抗生素治療后癥狀及肺部影像示肺部陰影均不見好轉。

2 結果

2.1 MP標本的鑒定測序情況

180例住院患兒FQ-PCR和PA法均為陽性共52例，應用巢式PCR技術擴增MP-23SrRNA基因，并對擴增產物進行測序，測出45例，另7例PCR擴增弱陽性，基因測序為亂碼，未能測出基因序列；此45例患兒MP-Ab達到1∶1280者37例，占82.2%；45例23SrRNA中均存在2063位A→G的點突變，其中2例為2063位點A/G雙峰；考慮為敏感株與耐藥株共存，突變率100%。MP測序結果見圖1～3。

2.2 45例突變MP所致肺炎主要臨床特點

2.2.1 一般臨床表現：91.1%的患兒表現為持續性發熱伴咳嗽?？人圆〕醵酁榇碳ば愿煽?，后期多伴有痰液。6例無熱或低熱均為3歲以內患兒；入院時平均熱程（6.09+3.25）d，總熱程（8.58+4.23）d；51.1%患兒熱程在6～9d，發熱超過15d者4例，其中1例同時患有水痘，1例合并EB病毒感染，各年齡段患兒熱程及體溫具體分布見表1，表2。

2.2.2 肺部體征：肺部有喘鳴音者18例，占40.0%，其中3歲以下兒童12例；8例既往有喘息病史。肺部有濕羅音者30例，占66.7%。一側呼吸音減弱者10例。

表145例患兒熱程分布情況T a b.1F e b r i l e d a y s o f t h e 45MP Pp a t i n t s Febrile days n（%） Age（year）0～5 8（17.8） 2.13±2.036～9 23（51.1） 6.00±0.0010～14 10（22.2） 6.15±3.40≥15 4（8.9） 4.25±1.71表245例患兒體溫分布情況T a b.2B o d y t e mp e r a t u r e 0f t h e 45p a t i e n t s Body temperature（℃） n（%） Age（year）36.0～37.2 4（8.9） 1.50±0.5837.3～38 2（4.4） 1.00±0.0038.1～39 24（53.3） 4.40±3.1039.1～41 15（33.3） 6.43±3.26

2.2.3 影像學檢查：32例行肺部CT，均表現有肺內炎癥，一側炎性滲出、模糊斑片影18例，雙肺炎癥9例，5例表現為大葉實變，6例合并有胸腔積液，其中2例為雙側。13例行胸部X線檢查，提示雙肺紋理增強，模糊7例；一側炎性滲出、模糊斑片影5例，大葉實變2例。

2.2.4 實驗室檢查：（1）31例外周血白細胞總數正常，占68.9%；其中24例伴有中性粒細胞比例較正常增高；余14例外周血白細胞總數有不同程度升高；尿常規中尿蛋白陽性1例；（2）血清測定EB病毒抗體陽性7例；肺炎衣原體抗體陽性4例；（3）CRP正常（≤8mg/L）23例，占51.11%；～20mg/L 10例，～40mg/L 4例，CRP>40mg/L 8例；ASO 42例正常，3例輕度增高；（4）肝功能ALT和（或）AST升高4例；心肌酶譜CK及CK-MB升高3例。

2.3 45例突變MP所致肺炎的肺外合并癥

本文45例基因突變MPP中20例有肺外合并癥，占44.4%；其中滲出性胸膜炎6例，均為4歲以上患兒；血液系統受累表現為輕度貧血3例；血小板增多6例；消化系統受累表現為惡心，嘔吐，腹痛2例；肝功能ALT和（或）AST升高4例；中樞神經系統受累3例，表現為精神狀態差，嗜睡，腦電圖顯示雙半球θ頻帶功率增高；心血管系統：心肌酶譜CK及CK-MB升高3例；皮膚受累4例，表現為蕁麻疹或斑丘疹；泌尿系統受累1例，表現為鏡下尿蛋白陽性，紅細胞及白細胞增多，無尿頻、尿急、尿痛等癥狀；結膜炎2例；所有肺外合并癥給予相應治療及對癥處理后均恢復正常。

2.4 治療與轉歸

45例患兒中有30例（66.7%）在入院前應用口服或靜點大環內酯類抗生素治療，平均用藥5.27d。入院后 45例均給予靜滴紅霉素，30mg·kg-1·d-1，療程 7～16d，平均住院時間（11.87+3.14）d；恢復期及出院后給予口服阿奇霉素1～2個療程序貫治療；10例肺部有喘鳴音者給予支氣管擴張劑及糖皮質激素吸入治療；合并其他感染者，同時選用相應敏感藥物治療。共治愈36例，好轉5例無效4例，有效率：91.1%。無效4例：均為年長兒，影像學檢查提示肺部大葉實變炎癥，2例伴胸腔積液，應用大環內酯類藥物治療5～7d后，發熱無下降趨勢，炎癥無吸收或范圍增大，予靜點甲強龍（1～2mg·kg-1·d-1）或/和丙種球蛋白（300～400mg·kg-1·d-1）治療 3d，患兒在治療后1～3d發熱逐漸消退，總熱程平均12.75d，平均住院13.5d。其中3例臨床癥狀均消失，肺CT提示炎癥較前吸收或好轉出院，1例患兒靜點甲強龍及丙種球蛋白3d后仍有低熱，復查胸片顯示炎癥較前吸收，退院。

3 討論

MP感染在全球范圍內均有發生，是各年齡段兒童急性上、下呼吸道感染的常見病原體之一［8］。本病發病年齡多為學齡兒童，本文統計各年齡段人數構成比無明顯差異，考慮可能與年長兒住院率較低、樣本量較小等因素有關。肺炎支原體肺炎多表現為持續性發熱伴刺激性干咳，本文患兒91.1%有此癥狀，早期查體多無陽性體征。表2可見患兒多表現為中高度熱，與國內辛德莉等［9］報道基本相符。由表1、2可見無熱、低熱及熱程較短的患兒均為3歲以內嬰幼兒，考慮與肺炎支原體對年幼兒的免疫損傷較弱有關［10］。本文統計患兒平均在發病后8.75d住院，行胸部X線或CT檢查均發現不同程度的肺部炎性改變，多數表現為沿肺紋理走形模糊斑片影，7例表現為大葉性肺炎，占15.55%?；純涸缙隗w征多不明顯，故應早期行X線檢查［11］。肺部聞及喘鳴音者18例，占40%，其中8例既往有喘息病史，10例為首次出現喘息。有文獻報道，MP是僅次于病毒引起患兒喘息反復發作的病原，且急性MP感染能誘發無癥狀患者哮喘的首次發作［12］。

隨著肺炎支原體肺炎發病率的上升，其肺外合并癥也逐漸增多，且全身各系統均可受累［13］。本文肺外合并癥20例，占44.44%。主要表現為肝功能異常、心肌受累、尿常規異常、皮疹、貧血，滲出性胸膜炎和眼結膜炎等，MP對肺外各系統的的致病機制尚不十分清楚，但主要傾向于免疫因素［14］。

目前兒童MP肺炎的治療主要選擇大環內酯類抗生素。然而近幾年來，世界各國不斷報道臨床患兒分離出MP，體外藥敏試驗證實為耐藥，基因測序發現主要為MP23SrRNA的2063或/和2064位發生點突變，且各個國家及地區所報道的突變比率差異較大。法國［4］自1994－2006年連續12年的一項監測報道，155例臨床分離株中有2株突變。美國［5］最近一項研究顯示，100株臨床分離株中有5株突變。德國Dumke等［6］報道2003-2008年167例臨床標本中也僅有2株突變。然而，日本2000-2006年研究顯示肺炎支原體突變率已從0（0/47）上升至30．6%（37/121）。本文45例均存在23SrRNA的2063位點的點突變，突變率達100%。與我國上海地區［3］同期報道一致。辛德莉等［15］（2009）報道北京地區突變率已達92%。

研究表明大環內酯類抗生素的耐藥機制主要是（1）靶位改變：基因突變或甲基化；（2）主動外排；（3）藥物滅活［16］；而 MP23SrRNA2063或 2064位點基因突變，是MP對大環內酯類抗生素主要的耐藥機制。目前對突變MP在體外對抗生素的藥敏試驗耐藥的結果與臨床療效關系的報道不多。據Suzuki等［17］報道，用大環內酯類抗生素治療肺炎支原體肺炎，MP耐藥株與敏感株所致肺炎相比，總的發熱時間約長3d以上，但是沒有出現大環內酯類抗生素治療失敗或病情加重的情況。本研究中未發現敏感株，但本文統計突變株所致總的平均發熱時間較Suzuki等［17］報道的敏感株明顯延長。另一文獻［1］報道，耐藥MP所致社區獲得性肺炎患兒中，由于持續發熱、咳嗽或胸部影像學提示炎癥無吸收或加重，應該用米諾環素或左氧氟沙星替代大環內酯類抗生素。盡管如此，從安全性方面來看，兒童仍不主張應用氟喹諾酮類及四環素類抗生素。本研究45例23SrRNA中均存在2063位A→G的點突變，其中2例為2063位點A/G雙峰，均采用大環內酯類藥物治療，45例患兒的臨床表現雖輕重不一，但應用大環內酯類抗生素治療，有效率達91.1%，對4例無效患兒，予加用甲強龍（1～2mg·kg-1·d-1）或/和丙種球蛋白（300～400mg·kg-1·d-1）治療 3d，1～3d 后肺部癥狀、體征明顯好轉，療效顯著。此4例用紅霉素治療無效的患兒，考慮為年長兒肺炎支原體感染后與機體的過度炎性反應或免疫損傷機制有關，加用激素或丙種球蛋白可抑制過強的炎癥反應，使這種免疫損傷減輕［10］。耐藥不會導致嚴重的臨床表現。因為肺炎支原體感染破壞免疫調節，可引起過強的炎性反應。由于本研究無大環內酯類敏感的23SrRNA非變異組的對照研究，因此肺炎支原體此位點突變與在體內是否耐藥的關系有待于進一步研究。

總之，MP突變株的產生應引起臨床醫師的高度重視。目前對于體外藥敏實驗及分子學改變證實的MP對大環內酯類耐藥的臨床意義尚不十分明確，對其所致肺炎的臨床表現尚無特異性，且應用大環內酯類抗生素治療絕大部分有效。臨床上又不能進行前瞻性的大規模人群的隨機試驗來研究大環內酯類耐藥與臨床療效的關系，因此有必要通過復制感染動物模型來研究各個危險因素對臨床療效的影響，比較大環內酯類藥物治療敏感及耐藥MP感染的療效，從而提高對體外耐藥MP所致肺炎的認識及診治水平，為臨床上合理應用抗生素提供參考，為新藥研發提供理論依據。

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（編輯裘孝琦，英文編輯王又冬）

Mutations of Mycoplasma Pneumoniae23SrRNAGene and Clinical Evaluation of Mutational Mycoplasma Pneumoniae Pneumonia

HAN Xiao-hua，LU Su-kun，LI Shu-xiu，LIU Li-yun，CHEN Ning，LI Shu-qin
（Department of Respiration Pediatrics，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo study the mutations of the23SrRNAgene of Mycoplasma pneumoniae（MP）and improve the recognition of the clinical situation and therapy of patients infected with it.MethodsPharynx specimens from 180inpatients with Mycoplasma pneumoniae pneumonia （MPP）from May to October of 2009.MP-23SrRNAgene was amplified by nested PCR and DNA sequencing was performed.Then we screened the mutational MP.The characteristics of the inpatients diagnosed with mutational MP pneumonia were analyzed and summarized．Results23SrRNAgene was found in 45patients by nested PCR and DNA sequencing.All had A to G mutation at position 2063，in which 2showed the coexistence of A and G.91.1%of the patients showed continuous fever accompanied by irritating cough；68.9%had normal peripheral blood white blood cell counts.Lung CT or X-ray image of the 45patients showed inflammation：14cases showed effusion or cloudy floc shadow in bilateral lungs；7showed lobar pneumonia，and 6developed exudative pleurisy.20cases had complications outside the lungs.All the patients were treated with erythromycin，and the effective rate was 91.1%．ConclusionThe 2063point mutation of23SrRNAgene is commomn in MPP patients，and the clinical manifestation is diverse.But the macrolides is effective for the treatment of the MPP patients.The relationship between point mutation in23SrRNAat position 2063and macrolide-resistant in vivo need further research.

Mycoplasma pneumoniae pneumonia；23SrRNAgene mutation；clinical manifestation；drug resistance

R563.1

A

0258-4646（2011）02-0162-05

doiCNKI：21-1227/R.20110212.0954.017

韓曉華（1962-），女，主任醫師，碩士.E-mail：hanxh5519@163.com

2010-11-12