紅細胞生成素對單側輸尿管梗阻大鼠腎間質纖維化的影響

鄧英輝，付文靜，張 沛

(首都醫科大學宣武醫院腎內科，北京100053)

紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種主要由腎臟分泌產生的活性糖蛋白，作用于骨髓中的紅系祖細胞，促進其增殖、分化。臨床主要用于慢性腎功能不全及腫瘤化療相關貧血的治療。近年來的研究顯示，EPO尚具有抗炎性反應、抗細胞凋亡及促進細胞增殖等作用，在急性腎損傷病理過程中發揮腎臟保護作用［1，2］，而對慢性腎臟病理過程是否具有保護作用尚存爭議。有觀察顯示，EPO可以減緩慢性腎小管間質性腎炎的病理過程，減輕慢性腎間質纖維化病變程度［3，4］。但也有研究認為，EPO可加重慢性腎間質纖維化的進展［5］。本研究采用單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠模型為研究對象，觀察EPO對慢性間質性腎炎及間質纖維化病理過程的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組 清潔級雌性SD大鼠 36只，體質量 250～300 g，隨機分為對照組(假手術組)、模型組(UUO手術組)和EPO治療組(UUO+EPO治療組)，每組各12只大鼠。其中模型組及治療組行單側輸尿管梗阻術:戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉大鼠，行腹正中切口，逐層打開至腹膜后，游離左側輸尿管，在輸尿管中上1/3處行雙重徹底結扎，于兩處結扎點中間剪斷輸尿管。然后逐層縫合，清潔傷口，建立UUO動物模型。假手術組僅行單側輸尿管游離，但不結扎，余處理方法相同。

1.2 實驗方法

1.2.1 給藥方法 EPO治療組在手術前1天及術后第2、5、8天給予EPO(重組人促紅細胞生成素注射液，沈陽三生制藥有限責任公司生產)腹腔注射(1000 U/kg)。對照組及模型組以等體積的注射用水腹腔注射。實驗期間大鼠自由進食水。

1.2.2 病理變化 術后第10天處死大鼠，取術側腎組織，10%甲醛溶液固定。常規石蠟包埋切片，經蘇木素-伊紅和過碘酸雪夫染色，光鏡下觀察腎小管間質病變程度，并測量皮質相對間質容積。

1.2.3 腎皮質轉化生長因子β1、α平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原表達的測定 免疫組化方法檢測腎皮質轉 化 生 長 因 子 β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α 平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和Ⅰ型膠原的表達。采用鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物法。載玻片應用 3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷防脫片處理，石蠟切片常規脫蠟至水，以新鮮配制的3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，然后滴加復合消化液37℃消化1 h。滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉20 min后，分別滴加不同的一抗，37℃孵育1 h，再滴加生物素化山羊抗小鼠或抗兔IgG，37℃孵育30 min后滴加鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復合物復合物，室溫下孵育30 min。最后加入二氨基聯苯胺顯色液，顯微鏡下控制顯色時間。蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。試驗同時采用磷酸鹽緩沖液替代一抗的方法作為陰性對照。一抗分別為兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體(中山生物公司)，兔抗大鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體(博士德生物公司)。

1.2.4 觀察指標的半定量分析 采用計算機圖像分析系統(HPIAS1000型)進行觀察指標的半定量分析。過碘酸雪夫染色切片在高倍鏡(200×)下隨機選擇10個腎臟皮質視野，測定腎間質面積占視野面積的百分比為相對間質容積值。同樣，免疫組化染色切片于高倍鏡下(200×)觀察，隨機選擇10個腎臟皮質視野，測定陽性染色面積占視野面積的百分比。視野面積中去除腎小球及大血管面積。

1.3 統計學方法 數據用SPSS11.0軟件處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析進行組間差異的比較，P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎小管間質病理變化 顯微鏡下觀察組織切片，UUO術后第10天，大鼠腎臟出現明顯的腎小管間質炎癥及間質纖維化病理改變，表現部分腎小管呈不同程度的擴張，上皮細胞水腫、變性、壞死，小管基底膜出現不同程度的斷裂、增厚，小管間質區域面積擴大，部分腎小管甚至出現萎縮、壞死。小管間質可見大量單核細胞與淋巴細胞浸潤，纖維化程度較為明顯。腎小球變化則較不明顯。對照組腎臟結構正常，腎小管排列緊密、整齊，小管基底膜光滑、連續，小管間質內無炎性細胞浸潤。腎臟皮質相對間質容積測定顯示:對照組為(12.14±1.61)%，模型組為(27.72 ±2.94)%，治療組為(22.11 ±2.62)%，三組比較差異有統計學意義(F=152.917，P＜0.01)，模型組和治療組的間質容積較對照組增加(P ＜0.01)，但治療組低于模型組(P ＜0.01)。

2.2 腎小管間質 TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原表達的變化 ①TGF-β1染色:對照組腎小管上皮細胞胞質內可見少量TGF-β1陽性染色，為顆粒狀，主要在近曲小管內。模型組與治療組TGF-β1在腎小管上皮細胞中表達明顯增多(與對照組比較，P＜0.01)，呈不均勻顆粒狀。治療組與模型組比較則明顯減弱(P＜0.01)，見圖1。②α-SMA 染色:對照組腎臟組織中α-SMA主要在血管壁上表達，小球和小管細胞中較少見陽性染色。模型組和治療組除血管壁上有表達外，尚可大量見于腎間質細胞胞質中，同時部分小管上皮細胞胞質內也出現明顯的陽性染色顆粒。模型組和治療組與對照組比較α-SMA染色顯著增加(P ＜0.01)，但治療組明顯少于模型組(P ＜0.01)，見圖2。③Ⅰ型膠原染色:對照組中，Ⅰ型膠原只在腎間質中有少量表達。模型組和治療組Ⅰ型膠原在腎間質中沉積明顯多于對照組(P＜0.01)，但治療組較模型組明顯減少(P＜0.01)，見圖3、表1。

圖1 各組大鼠腎臟組織TGF-β1的表達(免疫組化染色，光鏡200×)

圖2 各組大鼠腎臟組織α-SMA的表達(免疫組化染色，光鏡200×)

圖3 各組大鼠腎臟組織Ⅰ型膠原的表達(免疫組化染色，光鏡200×)

表1 各組TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型膠原免疫組化半定量分析

3 討論

近年來的研究發現，EPO可作用于多種類型的細胞，具有維持細胞生存、促進細胞生長的作用。人和嚙齒類動物腎臟的腎小球細胞、系膜細胞及腎小管細胞中均發現有EPO受體存在［1］。在急性腎功能不全動物模型中的觀察顯示，EPO具有減緩系統炎性反應、減輕腎小管損傷、抑制小管細胞凋亡和壞死、促進腎小管再生等腎臟保護作用，并且這種腎臟保護作用不依賴于EPO對貧血的糾正及對組織缺氧的改善［1，2］。EPO在慢性腎間質纖維化病理過程中是否具有腎臟保護作用尚存爭議。有研究顯示，在慢性間質性腎炎動物模型中，EPO可抑制炎性細胞浸潤、減少細胞外基質及膠原蛋白沉積、減輕腎間質纖維化程度，具有抗炎癥及抗纖維化作用［3，4］。但也有觀察認為，EPO可加重慢性間質性腎炎的炎性反應和小管損傷程度，促進小管萎縮及間質纖維化的發展［5］。

慢性腎間質纖維化是多種腎臟疾病發展至終末期的共同途徑。TGF-β1是最重要的促纖維化因子，在腎間質纖維化過程的多個環節中發揮作用。TGF-β1主要由活化的腎小管上皮細胞、T淋巴細胞、單核/巨噬細胞分泌。促進腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化是TGF-β1的重要作用之一，也是慢性腎間質纖維化病理過程的重要分子機制，其主要特征是腎小管上皮細胞失去其原有的細胞表型(如角蛋白、E-鈣黏蛋白等)，表達肌成纖維細胞的細胞表型，如α-SMA。表達α-SMA的肌成纖維細胞分泌細胞外基質的能力顯著增加。膠原蛋白是細胞外基質的重要組成成分。腎小管間質區域的膠原蛋白以Ⅰ、Ⅲ型膠原多見，主要來源于肌成纖維細胞。細胞外基質的異常合成和堆積是腎間質纖維化的主要病理特征之一。

UUO模型是經典的慢性腎間質纖維化動物模型。在UUO大鼠模型中觀察到，UUO術后第10天，患側腎臟出現明顯的間質纖維化病理變化，表現為炎性細胞浸潤，小管擴張、萎縮、壞死，細胞外基質及膠原含量增加，間質容積擴大。EPO處理后上述變化則顯著減輕，提示EPO具有明確的抗間質纖維化作用。在UUO模型組，TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原的表達明顯升高，與間質纖維化程度相符。TGF-β1主要表達于腎小管上皮細胞胞質內，以近曲小管為主。α-SMA可見于部分腎小管上皮細胞和腎間質細胞胞質內。這種改變提示病理狀態下部分腎小管上皮細胞活化，分泌TGF-β1增加;同時部分腎小管上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞，進而分泌膠原蛋白及其他細胞外基質成分，促進間質纖維化的發展。EPO則可以顯著抑制 TGF-β1及α-SMA的表達、減少膠原合成，改善腎間質纖維化的程度。國外研究也顯示相同的結果。如 Srisawat等［6］及 Park 等［7］學者的研究分別觀察到，EPO可明顯減緩UUO大鼠及小鼠腎臟的間質性腎炎及間質纖維化程度，具有明確的抗腎間質纖維化作用。EPO可抑制腎臟局部TGF-β1分泌和 α-SMA的表達，抑制腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化，減少膠原蛋白的分泌，進而減輕腎間質纖維化程度。De Beuf等［3］學者的研究顯示，在5/6腎臟切除的慢性腎功能不全大鼠模型中，EPO可明顯減輕腎間質的炎性細胞浸潤，減少膠原合成，抑制腎間質纖維化的進展。這與EPO抑制TGF-β1分泌、抑制其促纖維化作用有關;且EPO對TGF-β1分泌的抑制作用呈劑量依賴性。EPO發揮這種腎臟保護作用的劑量低于糾正貧血所需劑量，提示其腎臟保護作用不依賴于對貧血的糾正作用。體外培養的近端腎小管上皮細胞的研究也顯示，EPO可抑制TGF-β1介導的腎小管上皮細胞的凋亡及腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化［7，8］。這進一步提示EPO具有腎臟保護作用，且這種作用并不依賴于EPO對貧血的改善。

結合該研究和其他學者的研究顯示，EPO具有明確的抗腎間質纖維化作用，這種腎臟保護作用部分是通過EPO抑制腎小管上皮細胞活化和TGF-β1表達，阻止腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化完成的。關于EPO抗腎間質纖維化的詳細作用機制及對臨床實踐的意義尚需進一步研究。

［1］Sharples EJ，Yaqoob MM.Erythropoietin in experimental acute renal failure［J］.Nephron Exp Nephrol，2006，104(3):e83-e88.

［2］Spandou E，Tsouchnikas I，Karkavelas G，et al.Erythropoietin attenuates renal injury in experimental acute renal failure ischaemic/reperfusion model［J］.Nephrol Dial Transplant，2006，21(2):330-336.

［3］De Beuf A，D'Haese PC，Verhulst A.Epoetin delta as an antifibrotic agent in the remnant kidney rat:a possible role for transforming growth factor Beta and hepatocyte growth factor［J］.Nephron Exp Nephrol，2010，115(3):e46-e59.

［4］Lee SH，Li C，Lim SW，et al.Attenuation of interstitial inflammation and fibrosis by recombinant human erythropoietin in chronic cyclosporine nephropathy［J］.Am J Nephrol，2005，25(1):64-76.

［5］Rancourt ME，Rodrigue ME，Agharazii M，et al.Role of oxidative stress in erythropoietin-induced hypertension in uremic rats［J］.Am J Hypertens，2010，23(3):314-320.

［6］Srisawat N，Manotham K，Eiam-Ong S，et al.Erythropoietin and its non-erythropoietic derivative:do they ameliorate renal tubulointerstitial injury in ureteral obstruction?［J］.Int J Urol，2008，15(11):1011-1017.

［7］Park SH，Choi MJ，Song IK，et al.Erythropoietin decreases renal fibrosis in mice with ureteral obstruction:role of inhibiting TGF-beta-induced epithelial-to-mesenchymal transition［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18(5):1497-1507.

［8］Chen CL，Chou KJ，Lee PT，et al.Erythropoietin suppresses epithelial to mesenchymal transition and intercepts Smad signal transduction through a MEK-dependent mechanism in pig kidney(LLCPK1)cell lines［J］.Exp Cell Res，2010，316(7):1109-1118.