真武湯對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡的影響*

陳國慶 姚淮芳

1安徽中醫學院（安徽合肥230038）

2安徽省中醫院（安徽合肥230031）

慢性心力衰竭（CHF）的基本病因是原發性心肌損害以及前后負荷增加，與交感神經興奮，腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活密切相關。近年來研究證明，心肌細胞凋亡是CHF過程中心肌細胞喪失的重要機制，心肌細胞凋亡亢進參與了CHF的基本病理生理進程［1-2］。心肌細胞凋亡是心肌肥大向心衰轉化的關鍵因素。因此，抑制心肌細胞的凋亡對心衰的治療十分重要。選擇有效的藥物進行早期干預，打斷心力衰竭的惡性循環，就可延緩心力衰竭的發生發展。

1 材料與方法

1．1 動物及藥物 健康雄性 wistar大鼠 60只，體質量200～240g，購于安徽全椒動物公司。真武湯組成：熟附片10g，茯苓15g，白術10g，生姜15g，白芍15g。按比例配伍組成，加入500mL水，煎30min，過濾濃縮至1．0g/mL，由安徽省中醫院制劑中心提供。注射用青霉素，由華北制藥股份有限公司提供，批號：X1002321。依那普利片，由江蘇揚子藥業公司提供，批號H3202731。

1．2 主要試劑 Trizol試劑、逆轉錄試劑盒，PCR試劑和Taq DNA聚合酶，DNA Marker（美國Fermentas公司）、瓊脂糖凝膠（OXOID，英國），溴化己錠（10mg/mL，Sigma 公司，美國），引物用Primer Premier 5．0軟件設計，并由上海生工技術有限公司合成。bcl-2、bax、β-actin兔抗人單克隆抗體：購于博士德生物工程有限公司。羊抗兔IgG（辣根過氧化物酶標記），購于聯科生物技術有限公司。EZ-ECL增強型化學發光顯色試劑盒，購于Biological Industries公司。PVDF膜，購于Millipore公司。麗春紅，購于碧云天生物技術研究所?？捡R斯亮藍G-250，購于上海化學試劑廠?？捡R斯亮藍G-250蛋白測定試劑盒，購于南京建成生物工程研究。抗體稀釋液，購于博士德生物工程有限公司。

1．3 主要儀器 PCR儀器（美國ABI公司），DYY-6B型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠），TGL-18R冷凍離心機（黑馬儀器公司），TGL-16H冷凍離心機（黑馬儀器公司），紫外觀察燈UV型（珠海黑馬醫學儀器有限公司），GSM凝膠圖像分析管理系統（3．0），組織勻漿器，電子天平（JY2002，FA2004，上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠）。

1．4 分組與造模 大鼠隨機分為假手術組、模型組、真武湯組、依那普利組。每組15只。采用腹主動脈縮窄法制作CHF大鼠模型［3］：大鼠經 10%烏拉坦（1．0g/kg）腹腔注射麻醉后，行腹部正中切開，分離腎動脈上方的腹主動脈約1cm長，用7號針頭緊貼腹主動脈平行放置，并將兩者一起結扎，然后抽出7號針頭，即可使腹主動脈部分狹窄。術后，大鼠給予青霉素10000U，連續3d以預防感染。所有大鼠均飼以鼠飼料及瓶裝飲用水。各組均于造模4周后開始給藥。每日晨9：00，大鼠經口腔插管于胃內，真武湯組予真武湯 3mL/（kg·d），依那普利組予依那普利 10mg/（kg·d），假手術與模型組予生理鹽水 3mL/（kg·d）。

1．5 血流動力學指標測定 腹主動脈結扎3周后，觀察實驗動物是否出現失代償癥狀，如呼吸急促、心動過速和勞力性呼吸。以0．3%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，分離頸總動脈，插入聚苯乙烯左心導管至左心室，連接八導生理記錄儀（RM-600型）記錄其左心室壓峰值（LVP）、左室舒張末期壓（LVEDP）、左室內壓最大收縮率 （+LV dp/dtmax）、左室內壓最大舒張率（－LVdp/dtmax）及平均動脈壓（MAP）和心率（HR）。

1．6 RT-PCR方法測定Bcl-2、BaxmRNA的表達 取大鼠心肌組織，常規方法提取RNA，按RT-PCR試劑盒要求進行反轉錄反應和PCR擴增Bcl-2、Bax目的基因片段。Bcl-2上游引物：5′-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3′， 下游引物：5′-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′， 擴增片段長度為 431bp；Bax 上游引物：5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3′， 下 游 引 物 ：5′-TGAGGACTCCAGCCACAAAGA-3′，擴增片段 284bp；內參照 β-actin上游引物：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物：5′CACGTCACACTTCATGATGGAG-3′，擴增片段長度為 500 bp。PCR 反應條件為 94℃預變性 5min，94℃ 35s，54℃ 35s，35 個循環后，72℃ 35s，72℃延伸 5min，4℃ 99min。 PCR 擴增產物用 1%瓊脂糖凝膠電泳分離，掃描成像，用凝膠成像分析系統進行密度分析。以β-actin作為內參照。用各目的基因片段密度值/內參照密度值的比值進行比較。

1．7 Western Blot法檢測Bcl-2、Bax蛋白的表達 取大鼠心肌組織，常規方法提取蛋白質，定量，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，用一抗4℃孵育過夜，PBS漂洗3次后加二抗 HRP（辣根過氧化酶）-IgG（1∶1000），室溫孵育 2 h，化學發光法顯色，對條帶進行吸光度積分掃描。GAPDH作為內參照。用各蛋白吸光度值/內參照吸光度值的比值進行比較。

1．8 統計學處理 數據以（x±s）表示，應用 SPSS 12．0統計軟件。用單因素方差分析進行組間比較。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 真武湯對心衰大鼠血流動力學指標的影響 見表1。假手術組與模型組相比具有顯著差異（P＜0．01），模型組與中藥組、西藥組比較差異有統計學意義（P＜0．05），中藥組與西藥組比較無顯著差異。

表1 各組大鼠血流動力學指標比較 （±s）

表1 各組大鼠血流動力學指標比較 （±s）

與模型組比較，△P＜0．05，△△P＜0．01。下同。

組 別心率（次/min）-3123．89±989．57△△ 428．36±39．58△△-1342．87±826．48 328．17±32．73-2578．35±671．37△ 389．25±32．57△-2279．78±1297．68△ 372．40±27．68△n -dp/dtmax（mmHg/ms）15 15中藥組 15西藥組 15假手術組模型組LVSP（mmHg）135．09±28．09△△72．67±13．67 109．19±13．42△112．09±21．14△LVEDP（mmHg）12．98±9．87△34．45±10．01 7．89±11．36△5．98±12．03△+dp/dtmax（mmHg/ms）4523．17±1021．67△△1627．79±698．12 3421．17±874．02△3462．48±931．17△

2．2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達比較 與假手術組相比，模型組Bcl-2、BaxmRNA 及蛋白表達均顯著上升（P ＜ 0．01）；與模型組相比，真武湯組Bcl-2mRNA及蛋白表達均顯著上升，BaxmRNA 及蛋白表達均顯著下降（P＜0．05 或 0．01）。 見表 2、圖 1。

3 討 論

真武湯是醫圣張仲景《傷寒論》中溫陽利水代表方，主治少陰病陽虛水泛證。少陰病與CHF有密切的相關性，充血性心力衰竭心排出量不足時，末梢循環減弱，末梢血管收縮，表現為肢端發冷、蒼白、脈微細。這與少陰病心腎陽虛推血無力，陽氣不能溫煦四肢的見癥是相同的。據此許多學者應用真武湯治療CHF取得了顯著療效。本研究表明，真武湯對CHF心肌細胞凋亡有良好的抑制作用，作用與依那普利組相當，抑制心肌細胞凋亡為該方改善CHF的主要機制之一，也為臨床治療心力衰竭提供參考。

本文結果顯示，模型組有大量的心肌細胞凋亡，而假手術組幾乎沒有心肌細胞凋亡。盡管TUNEL標記陽性（凋亡小體）的細胞不一定是心肌細胞，但是近來的文獻報道幾乎所有的凋亡小體都是心肌細胞［4-5］。心肌細胞凋亡伴隨著上調有促進調亡作用的Bax蛋白表達，下調有抑制凋亡作用的Bcl-2蛋白表達，提示調亡蛋白表達失衡，促進了心肌細胞凋亡的發生，進而促進了CHF的發生、發展［6］。本研究發現模型組有大量的心肌細胞凋亡，表明細胞凋亡在CHF的發展過程中起了一定的作用，通過細胞凋亡喪失心肌細胞促進了CHF的發生發展。并且左室舒張末壓升高、收縮末期壓降低、室內壓最大上升速度與下降速度均減少，左心收縮功能、舒張功能明顯的下降，也發生了一定程度的心室重構，心肌細胞凋亡與心功能降低、心室重構有較強的相關性。

表2 各組 Bcl-2、Bax蛋白表達比較 （±s）

表2 各組 Bcl-2、Bax蛋白表達比較 （±s）

與假手術組比較，*P＜0．01。

組 別 Bcl-2 Bax n mRNA 蛋白 mRNA 蛋白0．41±0．04 0．63±016*真武湯組0．37±0．03 0．57±0．15*0．58±0．03△△依那普利組 0．68±0．16 1．47±0．14△△ 0．55±0．11△ 1．41±0．13△△假手術組0．66±0．04模型組 1．01±0．19*15 15 15 15 1．04±1．13△△0．91±0．13 1．18±0．15*2．12±0．26△△0．77±0．08△△

圖1 各組Bcl-2、BaxmRNA及蛋白表達電泳圖

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