乳腺癌線粒體細胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變檢測

閆斌 韓麗紅 于躍利

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國占全身各種惡性腫瘤的7%～10%。近年來，線粒體DNA（m itochond rial DNA，m tDNA）突變與腫瘤關系的研究越來越受到人們的重視，并且在多種人類腫瘤中都已檢測到m tDNA突變。本研究擬通過對乳腺癌組織m tDNA的細胞色素氧化酶-Ⅱ區測序分析，了解中國人乳腺癌m tDNA的細胞色素氧化酶-Ⅱ的突變情況，以期為乳腺癌病因學的研究提供實驗依據，并為臨床乳腺癌的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機收集2008年1月～2009年1月在包頭醫學院第一附屬醫院普外科切除的乳腺癌組織標本20例，以及對應的癌旁組織標本，標本取回后于-80℃冰箱保存，均經該院病理科證實為乳腺癌。

1.2 乳腺癌組織標本m tDNA的細胞色素氧化酶-Ⅱ區PCR擴增

按照DNA提取試劑盒（（Prom gea公司）說明書提取20例乳腺癌組織和癌旁組織的DNA。通過軟件分析設計出一對引物，上游引物：5’-atggcacatgcagcgcaag t-3’，下游引物：5’-ggtaaatacgggccctatttc-3’。PCR反應體系50μL，水33.5μL，10×bu ffer（無M g2+）5μL，上、下游引物各1μL，4×dNTP4μL，25mM的Mgcl24μL，Taq DNA聚合酶0.5μL（試劑均來自Promega公司），DNA模板1μL。PCR反應條件：94℃5m in；94℃15s，65℃30s，72℃40s，35個循環。產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120V，電泳30m in。凝膠成像分析系統觀察記錄結果。

1.3 測序及分析

由百泰克公司使用A BI3730X L測序儀對PCR擴增產物進行測序。測序果用Bioed it軟件進行分析，與Gen Ban k序列（AC_000021）對比，在PUBMED網上進行氨基酸序列比對，確定是否為突變。

2 結果

2.1 細胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴增產物結果，見圖1。

2.2 細胞色素氧化酶-Ⅱ測序結果統計

見表1。20例乳腺癌患者癌組織中共有4例m tDNA細胞色素氧化酶-Ⅱ區存在突變，突變率為20%。癌旁組織中共有2例m tDNA細胞色素氧化酶-Ⅱ區存在突變，突變率為10%。在20例乳腺癌組織中共有4個位點發生了突變，其中引起編碼氨基酸改變的突變有1個。

3 討論

腫瘤是多因素多步驟發展的產物，各種致癌物既然能有效地作用于m tDNA引起其產生與腫瘤相關的遺傳改變，那么m tDNA在腫瘤細胞中的生物學意義必將得到重視。因此，深入研究腫瘤細胞m tDNA的結構及表達調控變化，探討m tDNA突變與腫瘤的關系，對闡明細胞的癌變機制具有重要意義。目前已知多種腫瘤與m tDNA的突變有關，但對于它們的研究還只處于起步階段，還沒有得到m tDNA與細胞癌變直接相關的證據[1]。但有研究表明在小鼠癌細胞系中使用胞質雜交技術代替內生的m tDNA，結果顯示m tDNA突變能夠通過提高癌細胞的轉移能力促進腫瘤的發生[2]。

表1 20例乳腺癌組織和癌旁組織中細胞色素氧化酶-Ⅱ突變情況

圖1 乳腺癌組織細胞色素氧化酶-Ⅱ PCR擴增產物電泳圖

m tDNA突變已在多種人類惡性腫瘤中被證實，m tDNA自身的易受損性和組成性的氧化壓力使其缺陷成為惡性細胞的重要特征之一。但是，目前人們研究D-Loop區突變的比較多。本研究側重于研究細胞色素氧化酶-Ⅱ區突變，國內鮮有報道。

細胞色素氧化酶-Ⅱ是細胞色素氧化酶的活性中心，是細胞色素C電子傳遞的入口，也是細胞色素氧化酶電子泄露產生活性氧的主要部位，因此保持細胞色素氧化酶-Ⅱ的正常結構和功能對于維持正常的線粒體功能和細胞能量代謝具有重要作用。細胞色素氧化酶基因的突變不僅導致突變部位附近殘基的側鏈結構環境發生極大的變化（包括電荷性質、親疏水性質和空間特性），直接影響了酶復合物的形成，而且該酶幾個亞單位之間相互作用區域受到了影響，整個酶分子的穩定性大大下降[3]。大量證據表明，細胞色素C從線粒體釋放至胞質是引發凋亡的關鍵步驟。凋亡過程中細胞色素C的釋放是線粒體外膜通透性增高的結果[4]。線粒體在凋亡過程中起中心控制作用，而細胞色素C的釋放則是支配細胞命運的關鍵因素。有關這一信號途徑及其相關事件的認識，對進一步了解凋亡的正常生理和病理過程，及其在腫瘤中的失調控具有重要意義。

我們的研究在乳腺癌患者中細胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變率為20%，說明了在乳腺癌發生發展中線粒體細胞色素氧化酶-Ⅱ基因突變與乳腺癌的發生發展有關系。這些改變中，究竟哪些是多態性，哪些是與疾病相關的突變目前尚不清楚。這種突變的意義是正常多態性還是與乳腺癌密切相關尚不清楚，結合文獻我們認為，突變導致編碼氨基酸的改變可能引起線粒體功能異常，從而對乳腺癌的發病產生一定影響。雖然根據我們的結果尚不能認為m tDNA突變在乳腺癌發病中起決定性的作用，但m tDNA突變可能是發病過程中的一個前期或伴隨現象，即這種突變可能在乳腺癌的發病前就存在于體細胞線粒體，提高了發生乳腺癌的易感性。

在我們研究的乳腺癌組織中同樣有胞質異質性：線粒體幾乎存在于人體的所有細胞中，每個細胞中含有成百上千個線粒體，因此部分細胞在連續分裂過程中發生有絲分裂遺傳演變而導致組織中同時存在含野生型和突變型的兩種細胞，這種狀態稱為線粒體的胞質異質性。線粒體異質性是乳腺癌患者的一種較為普遍的現象。譚氏等研究發現在乳腺癌組織中約半數體細胞性突變處于異質狀態，其原因考慮有兩個方面：其一，由于在腫瘤標本取材過程中受到正常細胞的少量“污染”，在隨后的反應中使得“污染”得到數萬倍的擴增，因此，測序結果顯示為異質狀態。其二，已觀察到的異質性與腫瘤發生學上進展特征相同，可能代表著腫瘤的真實現象，而非污染所致。提示分子水平的改變發生在大體形態學變化之前，腫瘤發生是一個漸進的過程。

乳腺癌中m tDNA突變是比較普遍的，m tDNA突變可能是誘導核DNA突變的內源性因素之一。m tDNA突變可能會通過影響呼吸鏈的合成和核DNA與m tDNA基因相互調控，使核基因突變幾率增大以及引起細胞凋亡紊亂，對乳腺癌發生和發展可能起著比較重要的作用[5]。

總之，中國人乳腺癌中m tDNA突變是一個普遍的現象，它們在腫瘤的發生、發展過程中可能起著重要的作用。細胞色素氧化酶在人體內分布十分廣泛，它的突變與人類疾病發生有密切的關系，雖然檢測乳腺癌患者線粒體DNA編碼細胞色素氧化酶-Ⅱ基因的突變情況，但是突變位點氨基酸序列的改變、多肽疏水性的變化、蛋白質空間構想的改變等，還有很多問題仍需要進一步研究。

[1]張淑萍,宋書娟,李雅軒.人類線粒體DNA突變與癌癥[J].遺傳,2008,30（3）：263-268.

[2]Ishikawa K,Takenaqa K,Akimoto M,et al.ROS generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis[J]. Science,2008,320（5876）：661-664.

[3]蔡黔,周紅,徐淑芬,等.過氧化氫導致線粒體DNA編碼細胞色素C氧化酶基因突變與其編碼蛋白結構與功能關系的研究[J].中國現代醫學雜志,2004,14（1）：60-68.

[4]李娜,高俊巖,劉敏.細胞凋亡和腫瘤的關系研究進展[J].當代醫學,2009,15（16）：13-14.

[5]石楓,曾健.線粒體DNA突變與乳腺癌關系的研究進展[J].廣西醫學,2007,29（6）：856-858.