白細胞介素24對鼻咽癌CNE-2Z細胞株增殖的影響

李棟才，邱書奇，趙海亮，楊 貴，姚春燕

(深圳市龍崗中心醫院耳鼻咽喉科醫院，深圳市耳鼻咽喉研究所，廣東深圳518172)

鼻咽癌是我國華南地區、東南亞其他國家和地中海盆地的高發性惡性腫瘤，傳統的放療易出現局部復發及遠處轉移，因此尋找更有效的鼻咽癌治療藥物具有深遠意義。隨著分子生物學各項技術的日趨成熟，細胞因子的治療作為腫瘤治療的一個新靶點，已成為腫瘤防治研究的一個活躍領域。白細胞介素24(interleukin 24，IL-24)作為一種新發現的細胞因子，可選擇性地誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無影響，對鼻咽癌的治療有一定的應用前景。本研究通過細胞計數、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)抑制試驗探討其對鼻咽癌CNE-2Z細胞株增殖的作用，為今后鼻咽癌研究和治療提供實驗依據和研究思路。

1 資料與方法

1.1 鼻咽癌 CNE-2Z細胞株體外培養、細胞計數 鼻咽癌低分化細胞株CNE-2Z由廣東醫學院分子生物室保存，用含10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養液 37℃培養箱中培養，0.25%胰蛋白酶消化傳代。用含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養液調整細胞濃度為2×106/mL，在24孔培養板中加入細胞懸液 1.0 mL/孔，每孔細胞數 2 ×106，37℃、5%CO2、100%濕度培養72 h，臺盼藍染色活細胞率＞95%。分別按IL-24 0、5、10、20、50、100 pg/L接種細胞，每個濃度重復3孔，分別于培養 0、12、24、36、48、60、72 h 后收集細胞，0.05%臺盼藍染色，計數不著色細胞，計算存活細胞百分率。每4天半量換液。待細胞進入對數生長期后收集細胞作MTT試驗。

1.2 MTT比值法檢測細胞增殖抑制率 收集培養48 h的細胞至96孔板，每孔細胞數為2×105，血清濃度調整為10%，每孔體積為200 μL，每孔加 MTT 20 μL，37℃繼續培養 4 h;然后離心吸棄上清，每孔加二甲基亞砜200 μL，微量振蕩器上振蕩10 min，待紫色結晶完全溶解后，用酶標儀檢測各組細胞A570/A630吸光值，以0 pg/L IL-24組為對照組，計算IL-24對鼻咽癌細胞株CNE-2Z的抑制率。抑制率=(1－用藥組A值/對照組A值)×100%，作出量效關系曲線，尋找抑制率最高的IL-24濃度，就是IL-24作用的峰濃度。以峰濃度的IL-24為實驗組，不加IL-24為對照組，在培養的 12、24、36、48、60、72 h 后，用 MTT比色法檢測CNE-2Z的生長抑制率，作時效關系曲線，以了解細胞增殖狀況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 11.5統計軟件進行統計分析。本實驗數據資料以均數±標準差(±s)表示，多組間比較使用方差分析F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體外培養細胞計數的變化 鼻咽癌CNE-2Z細胞株在培養的第48 h生長狀況最差，并且隨著IL-24濃度的增加，其活細胞數也隨著減少。當IL-24為50 pg/L時，其增殖狀況最差;當 IL-24為100 pg/L時，其增殖狀況反而好轉(表1，圖1)。

表1 鼻咽癌細胞株CNE-2Z的增殖狀況(×104/mL)

圖1 體外培養的NPC細胞株CNE-2Z的增殖狀況

2.2 MTT比色法檢測 IL-24對鼻咽癌CNE-2Z細胞株的抑制率。

2.2.1 不同濃度IL-24培養48 h對鼻咽癌CNE-2Z細胞株增殖的影響 IL-24 濃度為 5、10、20、50、100 pg/L時，對鼻咽癌CNE-2Z細胞株的抑制率分別為(8.6 ±2.2)%、(14.6 ±3.1)%、(35.6 ±5.6)%、(58.0 ±6.8)%、(42.0 ±5.2)%，各時間點的抑制率比較差異有統計學意義(F=221.7，P ＜0.05)。IL-24濃度在0～50 pg/L范圍內，隨IL-24濃度增加，其對鼻咽癌 CNE-2Z細胞株的抑制作用遞增，當IL-24＞50 pg/L其對鼻咽癌CNE-2Z細胞株的抑制作用有所減弱(圖2)。

圖2 不同濃度IL-24在培養的48 h對鼻咽癌CNE-2Z細胞株增殖的影響

2.2.2 IL-24濃度50 pg/L作用不同時間點對鼻咽癌CNE-2Z細胞株增殖的影響 IL-24濃度為50 pg/L作用 12、24、36、48、60、72 h，對鼻咽癌 CNE-2Z細胞株的抑制率分別為(15.0 ±1.1)%、(17.0 ±1.6)%、(35.0 ± 2.5)%、(58.0 ± 4.6)%、(48.6 ±4.2)%、(46.0 ±4.6)%，各時間點的抑制率比較差異有統計學意義(F=492.9，P ＜0.05)。在 48 h內，隨著作用時間的延長，其抑制作用遞增，當作用時間＞48 h，其抑制作用有所減弱(圖3)。

圖3 IL-24 50 pg/L作用不同時間對鼻咽癌細胞株CNE-2Z增殖的影響

3 討論

鼻咽癌嚴重威脅人類的身體健康。世界大部分地區發病率較低，一般在1/10萬以下，其發病有著明顯的區域性和種族差異，好發于黃種人而白種人少見。盡管IL-24對乳腺癌、肝癌、直腸癌等細胞凋亡作用的研究已取得了較多的成果，但鼻咽癌作為中國南方多發的癌癥，目前有關IL-24對鼻咽癌細胞凋亡作用的研究比較少。

IL-24(mda-7黑素瘤分化相關因子)是近年來發現的很有應用前景的細胞因子，IL-24是一種潛在的腫瘤抑制劑［1］。應用外源性的IL-24可抑制多種腫瘤細胞的生長，并誘導其凋亡，但它對正常的細胞無損害［2-4］。IL-24基因可以在過表達水平下通過各種信號通路和途徑誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞沒有影響，且凋亡誘導作用不依賴p53、p21等抑癌基因的活性。更因為它同時具有抗血管生成以及抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移的作用，使得它在體內和臨床實驗中也可以取得良好的實際效果［5，6］，此外，也有體內試驗證實，將Ad-mda7處理后的纖維肉瘤細胞注射入小鼠，有免疫系統的小鼠中腫瘤細胞無法生長，而在無免疫系統的小鼠中腫瘤細胞卻可以生長［7］。目前一些抗腫瘤藥物［8］和免疫調節藥物［9］已在被嘗試與mda27基因聯合使用，以探索加強腫瘤殺傷效果以及克服耐藥性。而更新、更有效的病毒載體的探索也在進行中，比如用腺相關病毒1成功介導mda-7基因抑制腫瘤生長［10］，以及內質網靶向的腺病毒載體搭載mda27基因(Ad2ER2mda7)加強了對腫瘤細胞的殺傷作用［11］，這些都對如何更加有效地發揮mda27的抗腫瘤作用提供了研究思路和方向。

近來的研究表明，不需要通過腺病毒介導，純化的IL-24也可抑制多種腫瘤細胞增殖，并誘導其凋亡［12，13］。國內苑興卉等［14］以重組腺病毒作為載體通過凋亡實驗證實了mda-7基因針對鼻咽癌細胞株CNE-2Z的凋亡誘導效果;但純化的IL-24對鼻咽癌細胞株CNE-2Z增殖的影響尚未見報道。應用一定劑量外源性IL-24誘導其鼻咽癌細胞株CNE-2Z凋亡而不損傷正常細胞是否能成為有效治療該病的切入點，尚待進一步研究。

本實驗應用外源性的IL-24作用于鼻咽癌細胞株CNE-2Z，結果發現IL-24可呈時間和劑量依賴性地抑制鼻咽癌細胞株CNE-2Z增殖。應用細胞計數得出:IL-24可抑制體外培養的鼻咽癌細胞株CNE-2Z的增殖，在IL-24濃度為0～50 pg/L時呈劑量依賴性。而當IL-24濃度為100 pg/L時，其增殖狀況反而好轉，存在峰濃度效應;并且在第48小時其增殖情況最差。同時本實驗應用MTT比色法測定不同濃度IL-24作用后的細胞增殖受抑制的情況，得出IL-24對鼻咽癌細胞株CNE-2Z的抑制率呈明顯的峰濃度效應。IL-24濃度為50 pg/L時，對細胞的抑制率最高，低于或高于該濃度其抑制率均有所減低。并且在48 h其抑制率最高。細胞因子在刺激或抑制細胞增殖過程中，均存在峰值濃度，低于或高于峰值濃度，效果反而下降，峰濃度為最大效應濃度。IL-24作用的信號轉導都是通過與受體結合來實現，與受體結合可以使信號轉導蛋白和轉錄激活物3和信號轉導蛋白和轉錄激活物1發生磷酸化作用，同時向細胞核移動［13］。所以IL-24的峰濃度效應可能與受體飽和等因素有關，IL-24(50 pg/L)并不能完全抑制體外培養的鼻咽癌細胞株CNE-2Z的增殖，可能與鼻咽癌的病因、發病機制復雜有關。Yang等［15］報道，IL-24濃度為50 pg/L時，可明顯抑制A549細胞增殖，與本實驗結果相似。Cheng等［16］報道，IL-24可誘導體外培養的急性白血病核細胞凋亡，在培養的48 h，可見到DNA出現梯形條帶，該時間窗與本實驗相似，具體機制有待進一步探索。本實驗為今后鼻咽癌研究和治療提供了實驗依據和研究思路。

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