骨髓源干細胞移植與中藥蝮龍抗栓丸聯合治療對缺血再灌注大鼠腦內NGF的影響*

李 檀 金星光 王 玨 黃 寓 韓 冰

侯慶華2 鄭 權2 張家策2 池明宇1

1遼寧省血栓病中西醫結合醫療中心 （遼寧沈陽110101）

2遼寧省沈陽市血栓病研究所 （遼寧沈陽110101）

缺血性卒中發病率、致殘率和死亡率均較高，是威脅人類健康的重大疾病。骨髓間充質干細胞（BMSC）和骨髓單個核細胞（BMNC）通過分泌多種神經營養因子（NTF）、多向組織分化和調節免疫等機制，促進損傷、衰老器官的結構及功能修復，成為治療缺血性卒中理想的種子細胞。本實驗采用中藥復方聯合BMSC或BMNC蛛網膜下腔移植的方法治療缺血再灌注腦損傷大鼠，應用定量ELISA方法檢測和比較大腦中動脈梗死模型（MCAO）大鼠腦組織中NGF含量的變化，分析BMSC和BMNC經蛛網膜下腔移植，以及中藥聯合兩種細胞移植治療缺血性卒中的生物學機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：SPF/VAF級健康雄性wistar大鼠140只 （北京維通利華實驗動物技術有限公司），3-4月齡、體質量（280±20）g。 主要試劑：培養基 L一 DMEM（美國 GIBCO公司）；胎牛血清（美國GIBCO公司）；0.25%胰酶（美國GIBCO公司）；大鼠淋巴細胞分離液 （天津血液研究所）；ELISA試劑盒 （美國ADL公司）；蝮龍抗栓丸（遼寧省血栓病中西醫結合醫療中心提供，主要成分為天麻、菖蒲、黃芪、丹參、川芎、蝮蛇等，臨用時配成每毫升含生藥0.07875g的懸濁液）。主要設備：550微孔板酶標儀（美國Bio-rad公司）；MK2型洗板機（芬蘭雷勃公司）；移液器（德國Eppendorf公司）；倒置顯微鏡（日本 Olympus公司）；303-3CO2培養箱 （上海陽光實驗儀器有限公司）；DY89-11電動勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與干預 3-4月齡雄性Wistar大鼠140只，按隨機數字法分為7組：正常組、假手術組、模型組、BMNC組、中藥聯合BMNC組、BMSC組、中藥聯合BMSC組，每組20只。因手術意外等原因，最終納入112只，平均每組16只。術后24h進行蛛網膜下腔細胞移植，同時予蝮龍抗栓丸灌胃（劑量為3mL/只），每日1次，4d、28d取大鼠損傷側腦組織。

1.2.2 細胞的分離、培養和移植 密度梯度離心法分離BMNCs：3-4周齡雄性Wistar大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，無菌條件下取出雙側股骨、脛骨。剪掉兩端，PBS反復沖洗骨髓腔。將沖洗液置于percoll分離液上離心，收集中間單層細胞，洗滌待用。BMSCs的純化和培養：用含10%胎牛血清的L-DMEM培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度下常規培養。24h后換新培養液，去除未貼壁細胞，以后每3天換液1次。鏡下細胞生長融合達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化待用。

1.2.3 動物模型制備 按Zea Longa［1］改良線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞2h再灌注模型（middle cerebral arterial occlusion,MCAO）：3-4月齡雄性Wistar大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉。分離暴露右側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）、頸內動脈（ICA），結扎CCA，在根部結扎ECA，在CCA近頸內、頸外分叉處剪一小口，將末端燒成圓頭的4cm的尼龍線順勢緩慢送入ICA，深度約為（18±2）mm，結扎ICA，在MCA起始端堵塞MCA血流。血流阻閉120min后，抽出尼龍線，回復灌注。麻醉蘇醒后，NSS評分在6-12分的大鼠為造模成功。假手術組大鼠操作至暴露ICA、ECA，正常組大鼠不做處理。

1.2.4 蛛網膜下腔移植BMSC 將原代培養的BMSCs或直接分離獲得的BMNCs制成單細胞懸液，進行蛛網膜下腔穿刺注射，移植細胞總數為2×107個，體積為100μL。模型組以0.01M PBS液代替。移植方法：MCAO模型大鼠造模24h后，異丙酚尾靜脈注射麻醉，于枕骨大孔處用細針頭穿刺，將細胞以1μL/min進行蛛網膜下腔注射。

1.3 觀察方法 定量ELISA法檢測受損腦組織內NGF含量：水合氯醛麻醉下，手術取出MCAO大鼠右后側腦組織，進行適當稀釋和勻漿。美國ADL.inc.NGF定量ELISA檢測試劑盒，濃度單位1.0pg/mL，檢測步驟均參照試劑盒測試步驟進行。最終反應在微板酶標測定儀于波長450nm處讀取OD值。所測值按標準曲線換算成NGF濃度。

1.4 統計學處理 應用PEMS 3.1統計軟件。計量資料以表示 ，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

以標準品的平均光密度值為Y軸,對應濃度為X軸繪得標準曲線：Y=0.046Ln（x）-0.1374，R2=0.915,計算腦組織中 NGF 的含量，見表1。（1）治療干預后4d,模型組腦組織內NGF含量與正常組、假手術組、BMNC組和BMSC組接近（P＞0.05）；與模型組比較，中藥聯合BMNC組及中藥聯合BMSC組腦組織內NGF含量升高（P＜0.05）；BMSC組腦組織內NGF含量與BMNC組接近（P＞0.05），中藥聯合BMNC組和中藥聯合BMSC組腦組織內NGF含量較BMNC組升高（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯合BMNC組和中藥聯合BMSC組腦組織內NGF含量升高 （P＜0.05）；中藥聯合BMNC組與中藥聯合BMSC組腦組織內NGF含量接近（P＞0.05）。（2）治療干預后28d,模型組腦組織內NGF含量與正常組和假手術組接近（P＞0.05）；與模型組比較，BMNC組、BMSC組、中藥聯合BMNC組和中藥聯合 BMSC組腦組織內 NGF含量升高 （P＜0.05）；與BMNC組比較，BMSC組、中藥聯合BMNC組和中藥聯合BMSC組腦組織內NGF含量升高（P＜0.05）；與BMSC組比較，中藥聯合BMNC組和中藥聯合BMSC組腦組織內NGF含量升高 （P＜0.05）；中藥聯合BMSC組與中藥聯合BMNC組腦組織內NGF含量接近 （P＞0.05）。與本組治療后4d相比，各組腦組織內NGF含量差異無統計學意義。

表1 各組大鼠治療干預后4d、28d腦組織中NGF含量比較（pg/mL

表1 各組大鼠治療干預后4d、28d腦組織中NGF含量比較（pg/mL

與模型組比較，*P＜0.05 ；與BMNC組比較，△P＜0.05；與 BMSC組比較，▲P＜0.05。

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3 討論

近年來，應用BMSC和BMNC治療缺血性腦卒中的研究報道較多，但中藥復方與BMSC、BMNC聯合治療的報道較少，尤其是應用蛛網膜下腔注射方式進行干細胞移植的實驗研究國內罕見報道。本研究聯合了蝮龍抗栓丸和蛛網膜下腔移植同種異體BMSCSBMNCS到卒中大鼠腦內,進行腦組織中NGF因子含量的定量研究，進而嘗試一種新的移植方式和移植效率的檢測手段，比較BMSC和BMNC、以及中藥與BMSC、BMNC聯合移植對卒中大鼠腦內NGF含量的影響。

3.1 細胞移植途徑 干細胞經蛛網膜下腔移植在實驗研究方面報道較少，也尚無大規模臨床試驗報道。本研究采用此種方式進行細胞移植，結果證明在動物模型上安全、有效。移植細胞直接進入腦脊液，廣泛地參加腦卒中后組織代謝、替代與修復，不通過血管運送，無血腦屏障阻礙，最終進入腦內，歸巢到靶部位。移植創傷性較腦立體定位小，手術難度和風險較腦外立體定位和高選介入移植低，移植體積劑量和細胞數量較立體定位大，分布較廣泛，并且因無血腦屏障阻礙進入腦內的有效細胞數量較經血管移植多，費用較介入移植、腦外立體定位移植低。但是大鼠動物實驗中移植難度較大，應嚴格掌握進針角度、劑量、速度與移植時機，防止動物顱內高壓死亡。

3.2 BMSC和BMNC治療腦血管病的機制及其對腦內NGF的影響 骨髓源干細胞種類較多。BMSC是骨髓內非造血組織干細胞，尚未發現特異性抗原標記，在體內外可向骨、肌肉、肝臟、上皮、神經等多胚層分化［2-4］。BMNC是由骨髓提取的干/祖細胞混合群,含有如內皮祖細胞、造血干細胞、間充質干細胞、造血內皮母細胞等。由于細胞種類較多，移植后可多向分化。兩種細胞通過神經組織再生、分泌NTF［5］、促進血管新生、刺激內源性神經干細胞增值分化、抗凋亡、免疫調節等機制全面修復病變組織，治療腦血管病，成為臨床治療和研究缺血性血管病的熱點。

NGF是NTF中最早被發現的，廣泛分布于中樞神經系統。NGF具有神經營養、神經保護和促神經生長的生物學效應，對中樞及周圍神經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。腦缺血再灌注損傷后大鼠腦組織NGF水平變化不大，提示實驗大鼠對缺血再灌注神經損傷的自我修復能力有限。在移植早期（4d），單純BMNC/BMSC移植對NTF的影響不大；28d時，兩者均能上調NGF水平，且以BMSC能力更強。

3.3 中藥與干細胞移植聯合應用的意義 腦梗死屬中醫學“中風”范疇，其病機復雜，以氣虛血瘀、風火夾痰濁、夾血瘀痹阻脈絡為主要病機。蝮龍抗栓丸以益氣活血、息風化痰、化瘀通絡為治，對腦缺血損傷發揮治療作用。中藥復方聯合干細胞移植對腦內細胞因子代謝方面的研究少見，本實驗應用蝮龍抗栓丸聯合骨髓源干細胞對MCAO大鼠腦內NGF水平進行了研究。結果顯示，在移植早期，BMNC/BMSC尚未發揮作用時，蝮龍抗栓丸的聯合使用即可上調腦內NGF水平，較BMNC組提高了74.50%、較BMSC組提高了113.10%。至后期仍較單純BMNC/BMSC移植水平高，體現出蝮龍抗栓丸對BMNC/BMSC移植的彌補和協同作用。蝮龍抗栓丸與兩種細胞配合在上調NGF方面無時間和效率方面的差異。

總之,經蛛網膜下腔移植BMNC或BMSC在晚期能夠上調MCAO大鼠腦組織內NGF水平,中藥蝮龍抗栓丸的聯合應用可使NGF含量進一步提高，且時間提前，濃度更高，效果平穩而持久，彌補BMNC/BMSC移植不足的同時，又具有明顯的協同作用，更有利于受損神經組織的保護、再生和修復以及殘障神經功能的改善。

［1］ Longa Z，Weinstein P R，Carson S，et al.Revesible middle cerebral artery：without craniotomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

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