脂脈寧對酒精性脂肪肝大鼠血清和肝組織SOD活性及MDA含量的影響*

解慶凡 王建華 王曉貞 郭文平 張一昕

1河北省邢臺市人民醫(yī)院（河北邢臺054031）

2河北醫(yī)科大學中醫(yī)學院（河北石家莊050000）

脂脈寧為本課題組自行研制的治療酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）的中藥制劑，經多年臨床運用證實，療效確切［1］。據(jù)報道，氧應激與脂質過氧化損傷是AFL形成和發(fā)展的一個重要因素［2］。為了探討脂脈寧的作用機理，筆者觀察了其對AFL模型大鼠血清和肝組織超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影響。

1 材 料

1.1 動物 健康wistar大鼠70只，雄性，清潔級，體質量160～180g，購自河北省實驗動物中心（合格證號：1003046）。

1.2 藥物 脂脈寧膠囊：澤瀉、姜黃、山楂、石菖蒲、白術、皂角刺、大黃、何首烏等；由筆者所在醫(yī)院制劑室制備，實驗時用蒸餾水配制成所需濃度。東寶肝泰片為通化東寶藥業(yè)股份有限公司出品，批號為H22024764；實驗時用0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成所需濃度的混懸液。

1.3 試劑 天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）試劑盒均由北京中生生物工程高技術公司提供；SOD試劑盒、MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；膽固醇、膽鹽均購自北京奧博星生物技術責任有限公司；體積分數(shù)56%紅星二鍋頭白酒（北京紅星二鍋頭酒廠生產）。

1.4 主要儀器 半自動生化分析儀（德國毫邁克公司）、722型光柵分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、MSE-25型高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）、LAUDA-C3型循環(huán)恒溫水浴箱（泰克儀器有限公司）、日本日立H-7500型透射電子顯微鏡。

2 方 法

2.1 動物分組 將大鼠飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12h的清潔級動物實驗室內。正常喂養(yǎng)1周后，按體質量隨機分為5組：正常組、模型組、脂脈寧高、低劑量組、東寶肝泰對照組。除正常組10只外，其余各組均為15只大鼠。

2.2 造模與給藥 正常組用蒸餾水灌胃，進食普通飼料，自由飲水。其余各組參照文獻［3-4］造模：用體積分數(shù)56%紅星二鍋頭灌胃，體積分數(shù)從30%逐漸升至56%，梯度為每周升高5%，于第6周直接升至56%，并持續(xù)至第8周，同時喂飼高脂飼料（由1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、10%豬油和88%基礎飼料制成），自由飲水。大鼠造模的同時各組分別給予相應藥物灌胃，給藥劑量按藥理實驗方法學計算，脂脈寧高、低劑量組分別按2.0、1.0g/kg灌服脂脈寧，對照組按0.9g/kg灌服東寶甘泰片，正常組和模型組灌服蒸餾水，1次/d，每次用藥體積均按1mL/100g計算，持續(xù)8周。

2.3 標本處理 實驗8周末，于最后1次給藥后禁食12h。各組大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，低溫離心，分離血清，密封，-20℃冷存待檢。取血后迅速剖取肝臟，在肝臟最大葉距邊緣0.5cm處取0.5cm×0.5cm大小肝組織，用4%的多聚甲醛固定。另取適量肝組織用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸濕后，稱取濕質量約0.3g，加入預冷的生理鹽水，冰水中制成10%勻漿，4℃4000r/min離心10min，提取上清液，-20℃冷存待檢。

2.4 檢測指標 肝組織病理形態(tài)學觀察：取用4%多聚甲醛固定的肝組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。血脂和肝功能檢測：取血清在半自動生化分析儀上測定TC、TG、AST、ALT的含量或活性。血清和肝組織SOD和MDA的測定：SOD的檢測采用黃嘌呤氧化酶法、MDA的檢測采用硫代巴比妥酸（TBA）比色分析法，嚴格按試劑盒說明書檢測。

2.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以表示，采用方差分析、Student-Newman-Keul檢驗。血清中SOD活性=（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/50%×反應液總體積/取樣量）/組織中蛋白含量；組織中SOD活性=（對照管吸光度-測定管吸光度）/對照管吸光度/5%×（反應液總體積/取樣量）/組織中蛋白含量。血清中MDA含量=（測定管吸光度-測定空白管吸光度）/（標準管吸光度-標準空白管吸光度）×標準品濃度×樣品測試前的稀釋倍數(shù)；組織中MDA含量=（測定管吸光度-測定空白管吸光度）/（標準管吸光度-標準空白管吸光度）×標準品濃度/蛋白含量。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學變化比較 肉眼可見：正常組肝臟外觀呈紅褐色，柔軟富有彈性；模型組肝臟體積增大，邊緣鈍而厚，表面及切面呈灰黃色，油膩感；各用藥組之間肉眼觀察差別不明顯，色澤較暗，質地、彈性均介于模型組與正常組之間。HE染色后光鏡下觀察：正常組大鼠肝小葉結構正常，中央靜脈大而壁薄，肝細胞排列成肝索，在中央靜脈周圍呈放射狀分布，細胞呈多邊形，無濁腫、壞死，胞漿無脂滴，無炎性細胞浸潤。模型組大鼠肝小葉結構不清，肝細胞索紊亂，肝竇變窄，多數(shù)肝細胞濁腫、明顯脂肪變性，脂滴以大泡型為主，可見點狀壞死和炎性細胞浸潤。各治療組大鼠肝小葉結構清晰，肝細胞脂肪變性明顯好轉，肝細胞排列整齊，肝竇基本恢復正常，少量肝細胞濁腫，無炎性細胞浸潤和壞死。

3.2 各組大鼠血清TC、TG、ALT、AST水平比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量異常升高（P＜0.01），顯示AFL大鼠存在著明顯的血脂代謝紊亂和肝功能異常。給藥后，脂脈寧高、低劑量組和東寶肝泰對照組均能顯著降低實驗大鼠血清TC、TG、ALT、AST的含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。其中，脂脈寧高劑量組改善優(yōu)于東寶肝泰對照組（P＜0.05或0.01）。

表1 各組大鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比較

表1 各組大鼠血清TG、TC、AST、ALT水平比較

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜ 0.01；與東寶肝泰對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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3.3 各組大鼠血清和肝組織SOD活性和MDA含量比較 見表2。與正常組比較，模型組大鼠血清、肝組織中SOD活性均較正常組明顯降低（P＜0.05）、MDA含量均較正常組升高（P＜0.05或0.01）。各治療組大鼠血清、肝組織中SOD活性均高于模型組、MDA含量均低于模型組（P＜0.05或0.01）。脂脈寧高、低劑量組血清、肝組織中SOD含量均高于東寶肝泰對照組，MDA含量均低于東寶肝泰對照組（P＜0.05或0.01）。

表2 各組大鼠血清和肝組織SOD活性和MDA含量的比較

表2 各組大鼠血清和肝組織SOD活性和MDA含量的比較

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4 討 論

AFL在中醫(yī)學中無獨立的病名，根據(jù)其病因、病機及臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學 “酒疸”、“脅痛”、“傷酒”、“酒癖”、“酒脹”、“酒勞”、“積聚”等范疇。中醫(yī)學認為酒為濕熱有毒之邪氣，味甘，苦辛，性溫，有毒；入心、肝、脾、胃經。過量飲用則酒毒濕熱蘊結于中焦，損傷脾胃，濕濁內生，聚濕生痰，痰阻氣滯，肝失疏泄，氣滯血瘀，痰濕瘀毒相搏，結于脅下而成此病。病情纏綿不愈，日久則耗傷肝腎之陰。因此濕熱痰瘀互結，肝脾失調為AFL的主要病機，故脂脈寧選用澤瀉利濕消痰、泄熱；皂角刺祛痰散結；姜黃、山楂疏肝行氣、祛瘀通絡；石菖蒲、白術祛濕健脾；大黃通腑導滯，排除濕毒瘀積；何首烏補肝腎、益精血。諸藥合用，共奏祛濕泄熱、疏肝活血、健脾益腎之功。

SOD能夠清除氧陰離子自由基，保護細胞，間接反映了機體清除氧自由基的能力；MDA是氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸形成脂質過氧化物的一種，其量的變化常常反映體內脂質過氧化的程度，也間接地反映了細胞損傷的程度。這兩個指標反映了體內自由基的氧化和抗自由基的水平。關于AFL的發(fā)病機理目前尚不清楚，近年來有人提出以氧應激和脂質過氧化為中心的“二次打擊”假說［2］，國內外學者普遍認為細胞色素P450ⅡE1（CYP2E1）在酒精代謝過程中產生的氧自由基是造成AFL肝損傷的重要環(huán)節(jié)［5］。研究發(fā)現(xiàn)AFL肝臟中抗氧化物質明顯減少，氧自由基和脂質過氧化產物MDA含量明顯增高，自由基可與生物膜的含3個或3個以上雙鍵的脂肪酰脂質發(fā)生加氧反應產生MDA；MDA的兩個功能基又可與線粒體的膜質、膜蛋白NH2交聯(lián)形成西夫氏堿增加了膜的剛性，影響線粒體膜中酶的活性，導致線粒體功能異常，干擾脂肪酸β氧化，ATP生成減少，導致脂肪在肝臟沉積［6］。因此抑制氧化應激反應，增強細胞膜穩(wěn)定性，減少脂質過氧化產物的形成將有助于改善酒精性肝病肝臟損傷。

本研究顯示，模型組大鼠血清中 TC、TG、AST、ALT、MDA 和肝組織中MDA的含量明顯升高，血清和肝組織中SOD含量明顯降低，鏡下可見肝小葉結構紊亂，肝細胞索紊亂，肝細胞呈大泡樣脂肪變性，可見壞死灶和炎性細胞浸潤。經過藥物治療后，血清中TC、TG、AST、ALT、MDA和肝組織中MDA的含量明顯降低，血清和肝組織中SOD含量明顯升高，肝臟組織結構明顯改善。提示脂脈寧通過增強肝臟抗氧化能力，清除自由基，減輕脂質過氧化反應，以達到抗AFL的作用。此可能是脂脈寧治療AFL的作用機制之一。

［1］ 王曉貞.脂脈寧治療酒精性脂肪肝臨床療效觀察［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2010，12（2）：60-61.

［2］ Savas MC，Koruk M，Pirim I，et al.Serum ubiquitin levels in patients with nonalcoholic steatohepatitis ［J］.Hepatogastroenterology，2003，50（51）：738-741

［3］ 古賽，蔣小黎，何琳，等.大鼠慢性酒精性脂肪肝模型的建立［J］.重慶醫(yī)科大學學報，2006，31（1）：81.

［4］朱衛(wèi)豐，趙益，許可冀，等.東寶肝泰片防治大鼠酒精性脂肪肝的作用及機制研究［J］ .中國藥房，2009，20（28）：2179-2181.

［5］ Morgan K，F(xiàn)rench SW，Morgan T R.Production of acytochrome P450 2E1 transgenic mouse and initial eval-uation of alcoholic liver damage［J］.Hepatology，2002，36（1）：122-134.

［6］ Sampey B P，Korourian S，Ronis M J，et al.Immuno-histochemical characterization of hepatic malondialde-hyde and 4-hydroxynonenal modified protein during early stages of ethanol-induced liver injury［J］.Alcohol Clin Exp Res，2003，27 （6）：1015-1022.