基因敲除技術在結核病研究中的應用

田璽擇 張萬江

1989年,美國科學家 Capecchi[1]通過研究胚胎干細胞同源重組原理獲得的基因敲除小鼠取得成功,因此,Capecchi與美國科學家Smithies、英國科學家 Evans共同分享了2007年諾貝爾生理學或醫學獎,成為基因敲除研究史上的又一里程碑。經過20多年的不斷發展,基因敲除技術(gene knock-out)已經廣泛應用于生物醫學的各個研究領域,尤其在結核病研究中取得了很大進展,基因敲除技術已成為研究結核病發生、發展機制的重要技術手段。筆者綜述了基因敲除技術的原理及其在結核病研究中的應用。

基因敲除的原理、打靶載體的構建及其篩選策略

一、基因敲除的原理

基因敲除技術是建立在同源重組(homologous recombination)和胚胎干細胞(embryo stem cells,ESC)基礎之上的一種新興生物技術,也是研究基因功能的一種重要方法。首先要在體外構建攜帶突變基因的打靶載體,然后將其導入胚胎干細胞或體細胞中,利用基因的同源重組原理,用外源基因序列置換靶基因上的特定序列,通過研究靶基因與外源基因序列整合前后遺傳性狀的改變來研究靶基因的功能[2]。

由于傳統的基因敲除技術所得到的基因突變存在于轉基因動物的生殖細胞中,常出現因發育障礙而早期致死的現象,而條件性基因敲除技術可以將靶基因的修飾限制于特定的細胞或個體某一特定的發育階段,從而解決了這一難題。自1994年Gu等[3]利用Cre/LoxP重組酶系統研制組織特異性基因敲除小鼠獲得成功以來,條件基因敲除技術已被廣泛應用。條件性基因敲除(conditional gene knock-out)就是在基因敲除的基礎上,利用重組酶Cre介導的位點特異性重組技術,使得對小鼠基因組修飾的時間和范圍處于一種可控狀態。Cre重組酶可特異性識別loxP核酸序列,將loxP序列之間的目的基因切除,在特定階段、特定細胞中表達Cre重組酶的轉基因小鼠可以通過與在基因組中引入 LoxP序列的小鼠交配,使子代小鼠的特定細胞中的靶基因被刪除,從而得到了組織特異性Cre轉基因小鼠[4-5]。

二、基因打靶載體的構建策略

研究者可根據研究的需要選擇相應的載體類型,通常選用的打靶載體有插入型載體和置換型載體。插入型載體的同源序列與靶基因組特定位點發生同源重組后,整個載體整合到了靶基因組的特定位點上,而置換型載體的同源序列與靶基因特定位點發生同源重組后,載體的同源序列取代了靶基因組上的特定序列。

后來又出現了2種新的打靶載體構建策略,1991年Hasty等[6]提出了“hit and run”打靶策略,1993年 Askew等[7]提出了“tag and exchange”打靶策略。

三、基因打靶的篩選策略

由于大多數細胞難以發生同源重組介導的基因敲除,因而基因敲除成功的幾率很低。因此,要在基因打靶載體上添加正選擇標記基因及負選擇標記基因。正選擇標記基因有2個功能,一是作為選擇標記從轉染細胞中分離整合了外源基因的細胞;二是作為突變體置換或插入靶基因的編碼外顯子,使靶基因產生突變。負選擇標記基因的功能主要是對抗打靶過程中產生的非同源重組,起富集中靶克隆的作用[8]。通常選用的篩選策略有正負向篩選法(positive and negative selection,PNS)和PCR篩選策略。

正負向篩選法是指將正選擇基因neo插入到打靶載體同源區內的目的片段中,負選擇基因HSV-tk則插入到目的片段的外側。neo基因的插入既可形成基因突變,又是正向標記。而負選擇基因 HSV-tk對更昔洛韋(Ganciclovir,GANC)敏感,因此含有HSV-tk的重組細胞可在GANC培養基中被殺死[9]。

PCR篩選法就是在構建好的打靶載體上插入一段特定的核酸序列,通過PCR擴增產物的大小來鑒別插入突變和同源重組。

基因敲除在結核病研究中的應用

一、基因敲除在結核分枝桿菌對巨噬細胞凋亡作用研究中的應用

利用基因敲除技術來研究結核分枝桿菌與宿主巨噬細胞(macrophage)之間的相互作用,對于揭示結核病的發病機制具有重要的科學意義。被感染的巨噬細胞在病原體入侵后產生凋亡小體(apoptotic body)的能力是一種古老的先天免疫防御機制。對類似結核分枝桿菌一樣在細胞內長期存在的病原體來說,抑制巨噬細胞凋亡對于其侵入性是非常重要的。

編碼Ⅰ型NADH脫氫酶nuoG亞基的結核分枝桿菌nuoG基因,對結核分枝桿菌介導的抑制宿主巨噬細胞凋亡有重要意義。Miller等[10]利用基因敲除技術得到的結核分枝桿菌nuoG缺失株來研究結核分枝桿菌nuoG缺失株與巨噬細胞凋亡之間的關系,證實用半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-8及 TNF-α中和抗體來處理含有結核分枝桿菌nuoG缺失株的人巨噬細胞后,結核分枝桿菌nuoG缺失株的凋亡性表型有明顯降低。有趣的是,不僅nuoG敲除引起的凋亡可以使伴有活性氧拮抗劑的巨噬細胞潛伏期縮短,而且nuoG引起巨噬細胞分泌TNF-α能力的提高也能達到同樣的作用。這表明結核分枝桿菌通過nuoG依賴機制來抵抗活性氧的損害,以此來阻止TNF-α介導的宿主細胞凋亡,從而逃避巨噬細胞的殺傷。

巨噬細胞是結核分枝桿菌感染的天然微環境,為了抵抗氧化及亞硝基化,并在巨噬細胞內長久存活,結核分枝桿菌具備一種非常有效的抗氧化復合體系。在這些抗氧化劑酶當中,TpX是結核分枝桿菌中惟一與硫醇過氧化物酶有同源序列的蛋白,曾有研究者報道體內結核分枝桿菌 TpX蛋白的功能與體外過氧化物酶的功能相似,為了研究tpx基因對體內結核分枝桿菌的存活所起的作用,Hu等[11]通過基因敲除技術構建了結核分枝桿菌tpx缺失突變株,結果顯示該突變株不能在巨噬細胞中生長和存活,這說明tpx對于結核分枝桿菌抵抗氧化及亞硝基化是必需的。

二、基因敲除在結核疫苗研究中的應用

卡介苗作為預防結核病的接種疫苗,具有廣泛使用的安全性和免疫佐劑作用。ERP基因是既存在于有毒結核分枝桿菌又存在于卡介苗中的一個毒力基因,敲除卡介苗中的ERP基因有可能提高卡介苗對免疫缺陷患者使用的安全性。因此,利用基因敲除技術對卡介苗進行改進是開發新疫苗的一種有益嘗試。

吳芳等[12]利用基因敲除技術擴增ERP基因兩側序列,連接載體與目的片段,成功構建了卡介苗ERP基因的置換型打靶載體,為進一步構建敲除ERP基因的卡介苗突變株及研究新型結核疫苗奠定了基礎。

編碼Bruton酪氨酸激酶的btk基因突變可導致伴X染色體(X-linked immune deficiency,XID)的免疫缺陷,該免疫缺陷常伴有B淋巴細胞為主要表型的功能損害。Kondratieva等[13]在前期研究中證明CBA/N-xid小鼠和野生型CBA小鼠不同,在感染結核時不受卡介苗的保護。在T細胞反應性干擾素γ(IFN-γ-producing T-cells)和活化的巨噬細胞作為抗結核的關鍵因素后,仍然不清楚基因突變是為何主要影響沿T細胞-巨噬細胞反應軸的B細胞功能。因此,Tatiana等[13]利用基因敲除和繼承性細胞遷移的方法來論證說明先前未受重視的B細胞抑制中性粒細胞趨化作用的能力。證明B細胞缺陷會導致中性粒細胞異常快速的向外界刺激物遷移。在這項研究中,利用中性粒細胞代替巨噬細胞的方法可大量減少T細胞反應性干擾素γ和損傷的卡介苗,從而使一種更先進的卡介苗捕獲能力在XID小鼠中得以實現。

有研究表明存在于分枝桿菌細胞壁上的脂甘露糖阿拉伯糖聚糖(LAM)和脂甘露聚糖(LM)對機體免疫反應的調節有重要意義[14]。em bC基因則參與了前體LM合成LAM的關鍵環節[15]。李婭莎等[16]根據基因敲除方法,首先以質粒p2N IL為載體構建了卡介苗em bC基因打靶載體,篩選鑒定后將陽性克隆后電轉入卡介苗中,從而構建出卡介苗em bC基因敲除株,使其細胞壁上的LMs/LAMs的比例發生改變,為卡介苗免疫活性的研究奠定了可靠基礎。

三、基因敲除在結核分枝桿菌毒力基因研究中的應用

毒力基因的研究對于闡明結核的發病機理,開發抗結核新藥及結核疫苗有非常重要的意義。SecA1和SecA2是目前研究較多的毒力基因,在結核分枝桿菌中,SecA1是最基本的總務蛋白,而SecA2則是輔助分泌因子。Miriam等[17]通過基因敲除技術構建了結核分枝桿菌SecA2缺失突變株,該突變株在大鼠體內的毒力有明顯減弱。通過比較野生型結核分枝桿菌和SecA2缺失突變株,發現超氧化物歧化酶A(SodA)是依賴SecA2分泌的蛋白,而SodA缺乏經典的蛋白排出信號序列,提示SodA排出方式是一種新的分泌旁路,Miriam等[17]的研究表明這種分泌旁路是結核分枝桿菌逃避巨噬細胞殺傷的毒力機制之一。

已有研究表明,RD1是卡介苗和毒力菌株之間惟一有差別的區域,卡介苗不含RD1,而RD1存在于所有結核分枝桿菌有毒菌株中。Lewis等[18]敲除了H37Rv強毒株中的RD1基因,并研究其感染人單核細胞(T HP-1)、由人外周血單核細胞衍生的巨噬細胞及C57BL/6小鼠后的毒力變化,發現在以上3種系統中,H37Rv RD1基因缺失突變株的毒力比結核分枝桿菌的毒力有顯著下降,并與卡介苗類似。因此,研究RD1基因對于了解結核分枝桿菌的毒力及卡介苗的減毒作用都具有非常重要的意義。

結 語

基因敲除技術在結核分枝桿菌對巨噬細胞凋亡作用及結核疫苗的研究等方面應用較為廣泛,但在毒力基因、耐藥性及臨床診斷方面的應用較少。研究結核分枝桿菌毒力基因對于徹底了解和控制結核分枝桿菌具有非常重要的意義。目前,雖然成功證實了一些結核分枝桿菌的毒力基因,但對毒力基因的調控機制及其功能卻知之甚少,而基因敲除技術在基因功能的研究方面有其獨特的應用價值。由于基因敲除可以實現靶基因功能的完全喪失,而基因沉默是使基因不表達或低表達,因此其對毒力基因及耐藥基因功能的研究具有RNAi等基因沉默技術無法替代的作用。相信隨著分子生物學的快速發展,基因敲除技術在結核病各方面的研究中將會迎來更美好的應用前景。

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