耐藥結核病分子診斷技術研究進展

張軍

結核病（tuberculosis，TB）是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，是目前傳染病中威脅人類健康的頭號殺手。耐藥結核菌株的產(chǎn)生和播散，尤其是耐多藥菌株的出現(xiàn)，已成為新世紀結核病控制的三大難題之一。耐藥結核病尤其是耐多藥結核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR－TB）和廣泛耐藥結核病（extensively drug－resistant tuberculosis，XDRTB），是21世紀全球所面臨的最為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一，MDR－TB則有可能使結核病再度成為“不治之癥”，遏制耐藥結核病已經(jīng)成為非常迫切的研究課題。

分子生物學是指從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本質(zhì)、生命活動及其規(guī)律的一門學科。醫(yī)學分子生物學是其中的一個重要分支，它以疾病為中心，用分子理論和技術來研究人類疾病的預防、診斷、治療和發(fā)病機制等。分子生物學的發(fā)展為研究結核病耐藥性及結核病的傳播和流行開辟了一條新的途徑。筆者就耐藥結核病的分子生物學研究、結核病耐藥快速檢測方法及基因分型技術的研究進行了概述。

耐藥結核病的概念

1992年6月美國疾病預防控制中心（CDC）發(fā)表的有關耐藥肺結核的文章中，正式提出MDR－TB的概念。2006年，世界衛(wèi)生組織（WHO）出版了《WHO耐藥結核病規(guī)劃管理指南》［1]，規(guī)范了耐藥概念：（1）單耐藥（mono－resistance）：結核分枝桿菌對1種一線抗結核藥物耐藥；（2）多耐藥（polyresistance）：結核分枝桿菌對不包括同時耐利福平、異煙肼在內(nèi)的1種以上的一線抗結核藥物耐藥；（3）MDR－TB：是指患者排出的痰液中結核分枝桿菌至少對異煙肼和利福平2種抗結核藥物產(chǎn)生耐藥的結核病［2]。當實驗室藥敏報告結核分枝桿菌菌株對異煙肼、利福平耐藥，或經(jīng)WHO標準復治方案（2HREZS／1HREZ／5HRE）治療，仍然痰菌陽性，即可判斷為 MDR－TB［3]。

2006年3月24日，美國CDC首次提出廣泛耐藥結核病（extensively drug－resistant，XDR）的概念，即對異煙肼、利福平耐藥，并且至少對6類二線抗結核藥（氨基甙類、多肽類、氟喹諾酮類、環(huán)絲氨酸、硫胺類、對氨基水楊酸鈉）中3類藥物耐藥的結核病［4]。同時對任何氟喹諾酮類藥物耐藥，以及至少對1種二線抗結核注射劑（卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）耐藥。2006年10月在日內(nèi)瓦會議上 WHO將XDR－TB定義為：在 MDR－TB的基礎上，還對氟喹諾酮類藥物中的1種以及至少對以下3種注射藥物：卷曲霉素、卡那霉素和丁胺卡那霉素中的1種產(chǎn)生耐藥的結核病［3，5]。XDR目前在世界范圍內(nèi)最受關注，對社會、人類造成的危害也最大，在世界各國均有流行，是目前最為嚴重的一種結核病，治愈率很低，病死率極高［6]。

結核分枝桿菌耐藥機制

隨著分子生物學診斷技術的進展，抗結核藥物的耐藥機制逐漸被闡明。結核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性主要是由不合理用藥引起的結核分枝桿菌內(nèi)抗結核藥物作用靶基因突變所致，突變導致結核分枝桿菌耐藥的自然和獨立發(fā)生。具有先天耐藥突變的少量菌株在合理的耐多藥結核病治療期間很容易治愈。不充分治療和單藥治療會導致耐多藥菌株增殖，最終導致臨床上耐藥菌株的顯著增加。近年國內(nèi)外研究報告指出，耐藥結核分枝桿菌臨床分離株藥物靶編碼基因發(fā)生突變，與耐藥性密切相關，是結核分枝桿菌耐藥性的主要分子機制。

結核分枝桿菌的耐藥分子機制研究發(fā)現(xiàn)，其對異煙肼（isoniazid，INH）的耐藥性主要是由于過氧化氫－過氧化物酶的編碼基因（katG）突變或缺失或烯酰基還原酶編碼基因（inhA）突變以及烷基過氧化氫酶C編碼基因（ahpc基因）的突變［7]；結核分枝桿菌耐受利福平（rifampicin，RFP）主要是由于編碼RNA聚合酶的rpoB基因突變，使RFP與RNA聚合酶親和力明顯減小所致，現(xiàn)已知96%～99%的RFP耐藥性是由于rpoB基因中81bp核心區(qū)域的突變所引起［8]；鏈霉素（stréptomycin，SM）的耐藥主要是由于核糖體30S亞基S12蛋白的編碼基因（rpsl）和／或16SrRNA編碼基因（rrs）突變［8]；embB 基因突變是乙胺丁醇（ethambutol，EMB）耐藥性產(chǎn)生的主要原因，其次是embA基因突變；結核分枝桿菌耐受吡嗪酰胺（pynaziamide，PZA）主要是由于其吡嗪酰胺酶編碼基因（pncA）發(fā)生突變，使吡嗪酰胺酶活性喪失，不能將PZA轉變成活性型所致；編碼DNA螺旋酶A亞單位的gyrA基因發(fā)生突變是結核分枝桿菌耐受喹諾酮類藥物的共同機制。耐丁胺卡那霉素（阿米卡星，Amikacin，Amk）和卡那霉素（kanamycin，Km）的結核分枝桿菌中，ns基因突變?yōu)椋?7.4%），最常見的突變是1401位點A→G單堿基置換（60.5%）［9]，少數(shù)分離株為（1402位）C→T 或 A、（1484位）C→T，這些突變主要發(fā)生于高水平耐藥株，32.6%的耐Km分離株未發(fā)現(xiàn)ns基因突變，可能還存在其他耐藥機制。卷曲霉素（capreomycin，Cm）和紫霉素（viomycin，Vio）在結構上相似，結核分枝桿菌對Cm和Vio耐藥是由于tlyA基因（編碼rRNA修飾酶2′－O－甲基轉移酶）和ns基因突變所致，其中tlyA基因突變是耐藥性產(chǎn)生的重要原因。結核分枝桿菌基因ethA和ethR與乙硫異煙胺耐藥有關［9]。

但是并不是所有耐藥菌株均與相應基因突變有關，如部分臨床耐INH株約10%～20%未檢測到KatG、inhA基因改變，但存在編碼烷基過氧化氫還原酶亞單位的ahpC基因突變。少數(shù)耐RIF菌株并無rpoB突變，同時在少數(shù)敏感株組3%檢測到rpoB基因突變，提示RIF耐藥尚有其他機制［10]。

TB耐藥的主要機制是由于耐藥基因如rpsL、rpoB、katG、pncA、embB等突變所致，部分由于堿基缺失或插入所致，可能與遺傳相關［11]。大多數(shù)的耐多藥菌株是各種藥物作用靶分子的編碼基因逐步突變累積所致，而且各種突變之間存在一定的關聯(lián)，即染色體多個相互獨立基因自發(fā)突變的逐步累加是耐多藥的分子基礎，還未發(fā)現(xiàn)由單一突變引起的耐多藥菌株［10]。Morris等［12]研究表明，55%的耐多藥結核分枝桿菌同時存在rpoB、rpsl和katG基因突變。

目前國內(nèi)外耐藥結核分枝桿菌的分子生物學檢測方法

隨著分子生物學的發(fā)展，尤其是PCR技術的問世，建立于PCR基礎上的突變檢測技術也不斷涌現(xiàn)。利用分子生物學檢測方法來研究基因突變與耐藥性的關系，為耐藥性的快速測定奠定了基礎。

1.DNA直接測序技術（DNA sequencing）：是檢測結核分枝桿菌耐藥基因突變最直接、可靠的方法，是其他分子生物學方法的基礎。它利用PCR法擴增待測耐藥基因，產(chǎn)物純化或克隆化后取DNA片段直接測序，其堿基序列與標準敏感株的同一DNA片段比較異同，尋找堿基突變的位置和分布。該方法具有高通量、自動化程序高、自動數(shù)據(jù)處理等特點，已成功地應用于檢測rpoB、ndh、katG、rrs、rpsL等［13－15]位點的突變，24～48h即可提供精確序列，還可發(fā)現(xiàn)新的突變位點及應用于流行病學研究。但該法需在專門實驗室進行，操作煩瑣，費用昂貴，因此限制了它在臨床推廣應用，國內(nèi)外學者多用該方法作為評價其他檢測方法的參考。另外新一代DNA測序技術焦磷酸測序技術也開始用于基因多態(tài)性和耐藥基因的檢測，但該技術目前只能分析20～40bp的短序列，尚需進一步改進。

2.PCR－單鏈構象多態(tài) 性分析 （polymerase chain reaction－single strand conformation polymorphism，PCR－SSCP）：其原理是在某一條件下，單鏈（ss）核酸在溶液中會形成一定的二級結構，其堿基的組成會影響二級結構的形成。利用DNA單鏈構象具有多態(tài)性的特點，在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中，以無突變的DNA序列為對照，比較待測DNA與對照DNA在凝膠中遷移率的改變，就可判定待測序列中有無突變。與測序技術相比，PCR－SSCP操作簡單、快速、敏感、特異，成為使用較廣泛的檢測耐藥結核菌突變技術之一，如檢測rpoB、katG、rpsL 基因［13－15]等。但由于受檢測 DNA片段長度、膠的濃度、緩沖液的離子強度及電泳時的溫度等影響，并且SSCP還不能給出突變的具體位置和突變性質(zhì)，只能用于基因突變的篩選，因此限制了它的實際應用。

3.PCR－異源雙鏈形成 法 （PCR－universal heteroduplex generator，PCR－UHG）：Williams等［16]創(chuàng)立了在6h內(nèi)獲得快速檢測結核分枝桿菌RFP耐藥性的方法：先用巢式PCR擴增特異的rpoB基因片段，再與根據(jù)結核菌rpoB基因Rif區(qū)合成的通用異源雙鏈擴增子UHG（universal heteroduplex generator）探針雜交，如果標本中的結核菌rpoB基因無突變，則形成同源雙鏈構象，電泳后呈1條區(qū)帶；有突變，則形成異源雙鏈構象，電泳后除出現(xiàn)代表同源雙鏈構象的區(qū)帶外還出現(xiàn)其他條帶，確定其是否有RFP耐藥性。此方法對涂片染色陽性、未經(jīng)治療的患者尤為適合。值得注意的是，PCR－UHG是依據(jù)rpoB基因Rif區(qū)的核苷酸變化來確定其耐藥性的，少數(shù)標本有耐藥表現(xiàn)型（用BACTEC檢測），但不能查到其基因型變異，其耐藥機制可能是在Rif區(qū)外，或不在rpoB基因。Thomas等［17]應用該方法檢測RFP耐藥菌株，敏感度和特異度分別為83.0%和98.2%。

4.PCR－限制性片段長度多態(tài)性 （PCR－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）：因為基因突變，在限制性內(nèi)切酶酶切DNA片段時，其長度會發(fā)生變化，電泳得到其多態(tài)性變化。Nachamkin等［18]進行了一系列試驗來檢測結核菌的耐藥性，RFLP用于katG和rpsL基因突變的檢測，其特異度達100%，但其靈敏度卻只有28%；而檢測rpoB基因的異源雙鏈分析達到76%的靈敏度和97%的特異度。此法特異度較高，能分析已知序列是否存在某個位點的突變，但不知突變的性質(zhì)。由于不是所有突變都可以獲得或者限制性酶切位點的缺失，而限制了其在臨床上的應用［19]。

5.PCR－反向斑點雜交方法（PCR－reverse dot blot，PCRRDB）：該方法的原理是應用生物素或地高辛修飾的特異引物擴增DNA，特異寡核苷酸探針同PCR產(chǎn)物雜交與否來決定耐藥相關基因突變的存在狀態(tài)。該方法優(yōu)勢在于可以直接對臨床標本進行檢測，同時能夠一次對多種耐藥基因進行檢測并確定耐藥基因突變的部位和性質(zhì)，快速精確，具重復性，技術要求簡單，標本可批量處理，因此極具推廣應用的潛力。目前，比利時的Innogenetics公司和德國的Hain Lifescience公司已推出PCR－RDB MTB檢測試劑盒，用于分析RFP耐藥基因型，獲得較好的結果［20]。

6.基因芯片技術：其原理是將已用熒光標記的核苷酸靶序列（待測菌的DNA或RNA）與固定在芯片上的基礎探針雜交，通過激光共聚焦熒光掃描或電荷偶聯(lián)攝像機對每個探針分子的熒光信號強度進行檢測，以此來獲取待測標本分子的數(shù)量和序列信息。DNA芯片在確定PCR產(chǎn)物序列方面具有廣闊的應用前景，它的出現(xiàn)為僅用一次雜交確定大量序列提供了可能性。該方法的可行性已通過對人線粒體基因組完整序列的分析得到證實。利用基因芯片探針雜交方法可以對2個以上不同的耐藥性基因同時進行分析，如結核分枝桿菌對INH、RFP、EMB、PZA等多種藥物的耐藥基因都可同時進行檢測。該技術具有無可比擬的高效、快速和多參量的特點，是目前分子生物學最前沿的方法，可準確地確定突變位點和突變類型，現(xiàn)已廣泛應用于結核的菌種鑒定、耐藥性檢測及其基因組比較分析等研究領域［10]。

7.變性梯度凝膠電泳（DGGE）：其原理是雙鏈DNA在遞增的變性劑濃度梯度或溫度梯度中電泳時，DNA不同區(qū)段可根據(jù)不同的溶解溫度（Tm）而解離。雜交體中堿基的錯配會造成相應區(qū)段的不穩(wěn)定，致使同源體和雜交體之間相應區(qū)段的Tm差異可達6℃，野生型和突變型單鏈所形成的雜交體即可被區(qū)分出來。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前，需要通過預試驗來確定其最佳的電泳條件，以獲得最大的分離度。這需要一定的電泳條件，實驗室可自行操作。

8.熒光定量PCR：PCR是對原始待測模板核酸的一個擴增過程，任何干擾PCR指數(shù)擴增的因素都會影響擴增產(chǎn)物的量，使得PCR擴增終產(chǎn)物的數(shù)量與原始模板數(shù)量之間沒有一個固定的比例關系，通過檢測擴增終產(chǎn)物很難對原始模板進行準確定量。近年來研究人員通過大量的實踐，研究了相對準確的定量PCR方法，即熒光定量PCR，目前熒光定量PCR均采用外標定量。其主要原理：熒光共振能量轉移，外來光源激發(fā)供體熒光染料發(fā)出熒光，當其發(fā)射波長與受體熒光染料的吸收波長部分重疊，且兩者距離很近時，受體熒光染料吸收供體熒光傳遞的能量而激發(fā)出另一波長的熒光，同時將供體熒光淬滅。熒光定量PCR有如下顯著的優(yōu)點：特異度好，靈敏度高，線性關系好、線性范圍寬，操作簡單、安全、自動化程度高、防污染、速度快、高通量、可在2～3h完成96個樣品的定量分析［21]。

9.分子信標：為一莖環(huán)狀結構的寡核苷酸探針，其環(huán)狀區(qū)核苷酸序列與靶核酸互補，靠近兩端的部分序列互補構成分子信標的莖部，兩末端分別標記熒光基團和淬滅基團。當靶核酸存在時，莖部結構結合靶序列而打開，熒光基團和淬滅基團分開，產(chǎn)生熒光，熒光多少與莖部結構同靶序列結合的程度有關。

10.枝鏈DNA（bDNA）：是一個多重雜交系統(tǒng)，其檢測靈敏度大大提高。將靶DNA與固相固定的特異探針雜交，再加入另一特異探針與靶DNA雜交，此探針可結合一樹枝狀bDNA，標記有（AP）的探針與bDNA結合，加入發(fā)光底物，用發(fā)光檢測儀來測量發(fā)光強度，靈敏度高，接近PCR水平。已有人將此法用于細菌耐藥性檢測。

總之隨著分子生物學技術的不斷進步，結核分枝桿菌的檢測方法有一定的進展，但應看到并不是每種藥物只有一種耐藥基因，臨床的檢測手段在實際應用中有各方面的局限性，因此應尋找每種藥物全部耐藥基因，以及基因與耐藥之間的關系，建立快速、簡便、可靠的檢測方法對其耐藥性進行檢測，以指導臨床的早期治療和有效的控制結核病。

展 望

耐藥現(xiàn)象大大削弱了抗結核藥物的療效。早期檢測結核分枝桿菌耐藥性，對控制結核病極為重要。目前用于結核分枝桿菌耐藥性監(jiān)測的傳統(tǒng)方法耗時長，不能滿足臨床治療的需求，因此，國內(nèi)外都在尋找1種快速而且靈敏度高的監(jiān)測方法，以期快速的給臨床治療提供依據(jù)。由于結核菌耐藥機制復雜，常有多重耐藥，其耐藥性檢測也應選擇合適的方法，檢測多個耐藥基因，并結合傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法。目前DNA芯片技術發(fā)展迅速，可在同一載體上進行多個基因檢測，其具有高密度、高容量的特點，可導致一個量變到質(zhì)變的過程，將是非常好的耐藥性檢測手段。這樣可以在1個芯片上檢測結核分枝桿菌對幾種藥物的耐藥性，即加快了監(jiān)測速度又節(jié)約了成本。分子生物學檢測技術在鑒定結核分枝桿菌耐藥性方面比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法有明顯的優(yōu)勢，但由于結核分枝桿菌的耐藥性與基因突變的確切關系尚未完全闡明，加之生物學檢測技術靈敏度的限制（對某些藥物缺乏敏感度），基因突變型和其耐藥表型的不一致，以及未發(fā)現(xiàn)的耐藥基因的存在，使目前分子生物學檢測尚不能完全取代常規(guī)培養(yǎng)法來鑒定結核分枝桿菌的耐藥性。隨著分子生物學的發(fā)展，基因芯片技術的應用前景將會更加廣闊，建立簡便、靈敏、特異的快速測定方法，可以及時地為臨床治療提供依據(jù)。

［1] Word Health Organization.Guidelines for the programmatic management of drug－resistent tuberculosis.Geneva：WHO，2006：5－18.

［2] 高官聚，吳樹才，池躍朋.耐藥結核病的發(fā)生發(fā)展及控制展望.河北醫(yī)藥，2009，31（10）：1246－1248.

［3] 唐神結，肖和平.嚴重耐多藥結核病的成因與對策［J／CD] .中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2009，3（3）：62－66［2011－01－28] .http：∥www.cqvip.com／Read／Read.aspx？id＝29807489.

［4] 張麗，黃漢平，張茜.廣泛耐藥肺結核患者臨床分析.臨床醫(yī)學，2010，30（3）：22－24.

［5] World Health Organization.Guidelines for the programmatic management of drug－resistant tuberculosis：emergency update 2008.Geneva：World Health Organization，2008.

［6] Gandhi NR，Shah NS，Andrews JR，et al.HIV coinfection in multidrug－and extensively drug－resistant tuberculosis results in high early mortality.Am J Respir Crit Care Med，2010，181（1）：80－86.

［7] Choi JH，Lee KW，Kang HR，et al.Clinical efficacy of direct DNA sequencing analysis on sputum specimens for early detection of drug－resistant Mycobacterium tuberculosis in a clinical setting.Chest，2010，137（2）：393－400.

［8] Brown TJ，Herrera－Leon L，Anthony RM，et al.The use of macroarrays for the identification of MDR Mycobacterium tuberculosis.J Microbiol Methods，2006，65（2）：294－300.

［9] 俞學鋒，鐘利.結核分枝桿菌耐藥機制研究進展.西南軍醫(yī)，2010，12（1）：125－127.

［10] 吳長東，袁俐.耐藥結核病的分子生物學研究進展.中國病原生物學雜志，2009，4（12）：943－945.

［11] 楊松，張耀亭.結核病耐藥的分子機制及其防治研究進展.臨床肺科雜志，2006，11（5）：632－633.

［12] Morris S，Bai GH，Suffys P，et a1.Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.J Infect Dis，1995，171（4）：954－960.

［13] Kim BJ，Lee KH，Park BN，et a1.Detection of rifampin－resistant Mycobacterium tuberculosis in sputa by nested PCR—linked single－strand conformation polymorphism and DNA sequencing.J Clin Microbiol，2001，39（7）：2610－2617.

［14] Abal AT，Ahmad S，Mokaddas E.Variations in the occurrence of the S315Tmutation within the katGgene in isoniazidresistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Kuwait.Microb Drug Resist，2002，8（2）：99－105.

［15] 王巍，李洪敏，吳雪瓊，等.結核分支桿菌五種耐藥基因檢測的臨床應用及評價.中華結核和呼吸雜志，2002，25（11）：670－673.

［16] Williams DL，Spring L，Gillis TP，et al.Evaluation of polymerase chain reaction－based universal heteroduplex generator assay for direct detection of rifampin susceptibility of Mycobacterium tuberculosis from sputum specimens.Clin Infect Dis，1998，26（2）：446－450.

［17] Thomas GA，Williams DL，Soper SA.Capillary electrophoresis－based heteroduplex analysis with a universal heteroduplex generator for detection of point mutations associated with rifampin resistance in tuberculosis.Clin Chem，2001，47（7）：1195－1203.

［18] Nachamkin I，Kang C，Weinstein MP.Detection of resistance to isoniazid，rifampin，and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods.Clin Infect Dis，1997，24（5）：894－900.

［19] Victor TC，van Helden PD，Warren R.Prediction of drug resistance in M.tuberculosis：molecular mechanisms，tools，and applications.IUBMB Life，2002，53（4－5）：231－237.

［20] M?kinen J，Marttila HJ，Marjam?ki M，et al.Comparison of two commercially available DNA line probe assays for detection of multidrug－resistant Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol，2006，44（2）：350－352.

［21] Ling DI，Zwerling AA，Pai M.Geno type MTBDR assays for the diagnosis of multidrug－resistant tuberculosis：a meta－analysis.Eur Respir J，2008，32（5）：1165－1174.