戊型肝炎與疫苗

邵惠訓(xùn)

戊型肝炎是一種由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的急性胃腸道傳播的傳染病。戊型肝炎的癥狀與甲型肝炎類似，但病死率更高，癥狀更重，對(duì)孕婦、胎兒、老年人和慢性肝病患者的危害更大。孕婦病死率高達(dá)15%～25%[1]，幸存的孕婦極易發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和死胎。早在 1955年12月，印度新德里由于自來水水源受患者或動(dòng)物糞便污染，引起 29 000 例黃疸型肝炎流行[2]。隨后在亞洲廣袤地區(qū)發(fā)生了多次戊型肝炎流行，印度、中國、緬甸和尼泊爾為高流行區(qū)。1982年前蘇聯(lián)學(xué)者 Balayan 等將非甲非乙型肝炎患者糞便標(biāo)本，讓患過甲型肝炎的志愿者口服。36 d 后，出現(xiàn)典型的肝炎癥狀。用免疫電鏡技術(shù)從患者糞便標(biāo)本檢出圓球形病毒樣顆粒，并從患者恢復(fù)期血清檢出病毒抗體。1986 – 1988年在我國新疆南部地區(qū)發(fā)生了世界上最大的一次戊型肝炎暴發(fā)性流行，共發(fā)生病人 12 萬例，死亡 707 例，其中孕婦 414 例，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，影響了社會(huì)安定。

戊型肝炎是人畜禽共患的疾病。黑猩猩、恒河猴、獼猴、狨猴、鼠猴、梟猴、短尾猴、食蟹猴和非洲綠猴等靈長類動(dòng)物和豬、牛、羊、鹿、貓、狗、雞、鴨和大白鼠等均對(duì) HEV易感。從動(dòng)物分離的 HEV 與從人體分離的 HEV 在基因序列上高度一致。其中恒河猴是最理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在很多地區(qū)，豬是主要的儲(chǔ)存宿主和傳染源，戊型肝炎嚴(yán)重危害豬和禽類養(yǎng)殖事業(yè)。越來越多的動(dòng)物被發(fā)現(xiàn)對(duì) HEV 易感，但細(xì)胞培養(yǎng)病毒目前尚未成功。病毒經(jīng)人體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道黏膜進(jìn)入血流，到達(dá)肝臟進(jìn)行復(fù)制。病毒隨血流擴(kuò)散的同時(shí)，進(jìn)入膽囊，最后從糞便排出體外。HEV 進(jìn)入人體后，引起機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。產(chǎn)生的血清抗體有IgA、IgM 和 IgG。戊型肝炎發(fā)病后 1 個(gè)月，血清中有較高滴度的 IgA 抗體。發(fā)病后 5 個(gè)月，從血清中消失。IgM抗體在血清中出現(xiàn)較早。病毒感染后 1 周，在血清中出現(xiàn)，3 個(gè)月后消失。IgG 抗體在發(fā)病后 9 d 就能從血清檢出，滴度高，在血清中能持續(xù) 10 多年[3-4]。

1 HEV 的基因結(jié)構(gòu)、編碼的蛋白與機(jī)體免疫應(yīng)答

HEV 屬肝炎病毒科（hepeviridae）肝炎病毒屬（hepevirus），是單股正鏈 RNA 病毒，無囊膜，表面有纖突。20 面體對(duì)稱，病毒顆粒直徑為27～34 nm。病毒有實(shí)心和空心兩種，有 8 種基因型。1 型主要在亞洲和非洲人群中流行，以緬甸株為代表；2 型在墨西哥和非洲尼日利亞和納米比亞等國流行，以墨西哥株為代表；3 型能感染人和豬，分布廣泛，包括發(fā)達(dá)國家，如美國和日本多見[5]，3 型再分為10 個(gè)亞型（3a～3j）；4 型在亞洲的人群和豬群中流行[6]，在我國豬群中流行的病毒主要是 4 型，也有少數(shù)3 型，4 型再分為7 個(gè)亞型（4a～4g），4 型肝炎比 3 型嚴(yán)重；5 型感染鳥類；5～8 型流行于歐洲。在我國以 1 型和 4 型為主。從不同地區(qū)分離到的病毒，存在明顯基因差異，而同一地區(qū)來源的 HEV 的基因序列相對(duì)穩(wěn)定[7]。HEV只有一個(gè)血清型。基因組長 7.3 kb，由一個(gè) 25 nt 的 5′ 端非編碼區(qū)（UTR）、三個(gè)開放讀碼框架（ORF1、ORF2 和ORF3）和一個(gè) 65～74 nt 的末端為多聚腺苷酸（polyA）的3′UTR 組成。病毒基因組由 5′UTR 到 3′UTR 依次為5′UTR-ORF1-ORF3-ORF2-3′UTR 和 poly A 尾。ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，包括甲基轉(zhuǎn)移酶、半胱氨酸蛋白酶、RNA 解旋酶和 RNA 聚合酶。ORF2 編碼 660 個(gè)氨基酸的糖基化結(jié)構(gòu)蛋白。ORF3 與 ORF2 有 331 nt 重疊，編碼 123 個(gè)氨基酸殘基的磷蛋白，能與細(xì)胞骨架蛋白和病毒衣殼蛋白結(jié)合，可能參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳達(dá)[8]。HEV 的結(jié)構(gòu)蛋白主要由 ORF2 基因編碼，含蓋了主要抗原表位和主要抗原決定簇，帶有明顯信號(hào)肽序列。用 ORF2 基因表達(dá)的重組抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，能成功保護(hù)機(jī)體免受 HEV 的攻擊[9]。ORF2衣殼蛋白高度保守，免疫原性強(qiáng)，其產(chǎn)生的抗體具有中和性保護(hù)作用，在機(jī)體內(nèi)維持時(shí)間很長，而且是引起細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要抗原。ORF3 蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但此抗體在體內(nèi)維持時(shí)間很短。ORF1 蛋白免疫原性很弱，又不是病毒的結(jié)構(gòu)成分，其抗體不具有保護(hù)作用。介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原表位存在于 ORF2 蛋白，而非 ORF3 蛋白。人體感染 HEV 后的免疫反應(yīng)主要由 ORF2 蛋白引起，體液免疫和細(xì)胞免疫同時(shí)存在。肝細(xì)胞損傷與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。

2 HEV 感染實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

2.1 免疫電鏡技術(shù)（immune electron microscopy，IEM）

用常規(guī) IEM 檢測(cè)患者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物的糞便和膽汁中的HEV，用標(biāo)記的抗-HEV 抗體可檢測(cè)肝細(xì)胞中的 HEAg。IEM 需要配置電鏡等特殊設(shè)備和培訓(xùn)相關(guān)技術(shù)人員，患者排出病毒時(shí)間較短，病毒在外環(huán)境下又不穩(wěn)定。IEM 準(zhǔn)確性雖高，但靈敏度很低，限制了此法推廣使用。

2.2 免疫熒光技術(shù)（indirect immunofluorescent assay，IFA）

從實(shí)驗(yàn)感染 HEV 的獼猴血清或單克隆抗體提取 IgG，經(jīng)熒光素標(biāo)記，用 IFA 法檢測(cè)肝細(xì)胞中 HEAg，也可用免疫熒光抗體阻斷法檢測(cè)血清中抗-HEV。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

抗原應(yīng)包括當(dāng)?shù)刂饕Y(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白。應(yīng)用桿狀病毒為載體，在昆蟲細(xì)胞（真核）表達(dá)的 ORF2 和 ORF3 結(jié)構(gòu)蛋白羧基端（C 端），其抗原表位構(gòu)象接近自然狀態(tài)，具有很高免疫原性。用純化的抗原蛋白包被在微量塑料板孔內(nèi)，加入被檢血清，然后加入抗人 IgG（γ 鏈）、或抗人 IgM（μ 鏈）、或抗人 IgA（α 鏈）酶結(jié)合物，再加入底物顯色。分別檢測(cè)血清標(biāo)本中 IgG、IgM 或 IgA 抗體[10]?，F(xiàn)已研制出第3 代 ELISA 診斷試劑，并已商品化。國內(nèi)用大腸桿菌（原核）表達(dá)的抗原制備 ELISA 試劑盒，也能取得良好檢測(cè)效果。用原核或真核表達(dá)的 ORF2 和 ORF3 抗原蛋白，對(duì)急性期血清有較強(qiáng)活性，但對(duì)恢復(fù)期血清反應(yīng)性較差。ELISA 已成為HEV 感染的診斷常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。

2.4 蛋白印跡試驗(yàn)（Western blot assay，WBA）

其靈敏度和特異性均較 ELISA 為高。將聚丙烯酰胺凝膠上的 HEV 融合蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜上，與被檢血清中的 IgG、IgM 或 IgA 作用，加入抗人 IgG（γ 鏈）、抗人 IgM（μ 鏈）或抗人 IgA（α 鏈）酶結(jié)合物，再加入底物顯色。

2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）

檢測(cè)患者血清和糞便中的 HEV RNA。先從被檢標(biāo)本中提取 RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在相應(yīng)引物引導(dǎo)下進(jìn)行基因擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，置紫外燈下觀察，通過與標(biāo)準(zhǔn)分子量的 DNA 比較，作出結(jié)果判斷。在我國流行的 HEV 基因是 1 型和 4 型，根據(jù)這兩型序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)的引物，檢測(cè) HEV RNA 的靈敏度高于通用引物。本法靈敏度高，特異性強(qiáng)，但在操作過程中易發(fā)生實(shí)驗(yàn)室污染而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。也可用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè) HEV RNA，其比 RT-PCR 靈敏 10～100 倍。

2.6 核苷酸序列分析（nucleic acid sequence analysis）

從患者血清提取 HEV RNA，通過 RT-PCR 擴(kuò)增 ORF2區(qū) cDNA 片段，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。采用 Sequence Version 2.0 DNA 序列分析試劑盒，以同位素 γ-32P 末端標(biāo)記引物，經(jīng)雙脫氧核苷酸 DNA 鏈末端終止直接測(cè)序法，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列。此法用于病毒分型、傳染源探索和分子流行病學(xué)研究。

3 HEV 感染的流行特征

3.1 傳染源

人和靈長類動(dòng)物、家畜和家禽都可作為傳染源。豬是人類 HEV 感染的病毒存儲(chǔ)庫，是主要傳染源和動(dòng)物宿主[11]。曾從屠宰場(chǎng)污水、豬圈外排水道標(biāo)本分離出病毒。亞臨床型感染者是戊型肝炎的主要傳染源。潛伏期末期和急性期早期的患者傳染性最強(qiáng)。戊型肝炎潛伏期比甲型肝炎更長。

3.2 傳播途徑

3.2.1 經(jīng)水傳播 水源被患者糞便或動(dòng)物糞便污染，常引起暴發(fā)性流行。歷史上幾次大的流行都與水源被污染有關(guān)。

3.2.2 經(jīng)食物傳播 食物在生產(chǎn)、加工和流通過程中被病毒污染，可引起家庭內(nèi)和集體食堂內(nèi)的小型暴發(fā)。豬肉、豬肝、鹿肉和海產(chǎn)品能攜帶病毒，食用未煮熟的豬肉、豬肝、鹿肉和海鮮都能引起發(fā)病[12]。2009年頒布的《食品衛(wèi)生法》首次將戊型肝炎列為食品從業(yè)人員健康體檢的必檢項(xiàng)目。

3.2.3 人與人之間傳播 人感染后，從糞便排出病毒時(shí)間較長，病毒在自然界不易被滅活。人與人之間可通過糞口途徑腸道傳播或日常生活接觸傳播。2007 – 2009年在烏干達(dá)難民營的戊型肝炎疫情中，HEV 發(fā)生了人與人之間的傳播。沒有通過性傳播的報(bào)道[13]。

3.2.4 垂直傳播 懷孕婦女感染病毒，病毒通過胎盤使胎兒感染。印度曾報(bào)告，孕婦 HEV RNA 陽性，其新生兒100%發(fā)生急性戊型肝炎。

3.2.5 經(jīng)血液傳播 輸入含有 HEV 的血液，使受血者發(fā)生戊型肝炎。病毒血癥時(shí)間很短，但輸血不是主要傳播方式。

3.2.6 媒介傳播 蒼蠅和蟑螂等節(jié)肢動(dòng)物將糞便中的病毒帶到食物上造成疾病傳播。

3.3 易感人群

人群普遍對(duì) HEV 易感。兒童感染 HEV，多為隱性感染；成人則多顯性感染。病后有一定免疫力。

3.4 流行病學(xué)特征

3.4.1 地區(qū)分布 戊型肝炎是一種世界性傳染病。在世界很多國家和地區(qū)有過散發(fā)或暴發(fā)。印度新德里在 1955年發(fā)生水型流行后，每隔數(shù)年都要發(fā)生流行，并擴(kuò)散到整個(gè)印度次大陸。1991年2月和 4月，在印度坎普爾發(fā)生了7.9 萬例病人的大流行。據(jù)歷史記載，發(fā)生萬人以上的暴發(fā)已有 9 次之多。在非洲尼羅河流域，散發(fā)肝炎中 HEV 是主要致病因子。在美、英、日等發(fā)達(dá)國家旅游者到疫區(qū)旅游，感染了病毒，回國后發(fā)病[14]，也可由當(dāng)?shù)氐膭?dòng)物傳播而引起的散發(fā)病例。在我國大部分省區(qū)都有過本病的散發(fā)或暴發(fā)流行的報(bào)道。

3.4.2 性別和年齡分布 散發(fā)時(shí)，男性發(fā)病多于女性。發(fā)病以青壯年為主。

3.4.3 季節(jié)分布 有明顯季節(jié)性，雨季多見。洪水后易發(fā)生流行。

4 HEV感染的預(yù)防

4.1 一般性預(yù)防措施

采用切斷傳播途徑為主的綜合性預(yù)防措施。加強(qiáng)飲用水衛(wèi)生管理，保護(hù)水源。改善供水條件，保證安全用水。加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)督和食品衛(wèi)生監(jiān)督，改善居住條件，合理處理人畜禽糞便，防止糞便污染水源和周圍環(huán)境。加強(qiáng)衛(wèi)生宣傳教育，養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣，提倡喝開水，不喝生水。不要食用半生不熟的毛蚶和海蟹等貝殼類水產(chǎn)品。孕婦要遠(yuǎn)離戊型肝炎患者。加工豬肉、海產(chǎn)品時(shí)要做到生熟分開。到疫區(qū)旅行時(shí)，要特別注意飲食衛(wèi)生。

4.2 疫苗免疫

接種疫苗是預(yù)防戊型肝炎最主要的措施。目前正在研制的疫苗有基因工程疫苗、DNA 疫苗和重組蛋白疫苗等[15-16]。

由國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心（廈門大學(xué)夏寧邵團(tuán)隊(duì)）等單位聯(lián)合研制的戊型肝炎疫苗取得了重大成果。病毒基因來源于 HEV 基因 1 型，抗原片段選用HEV 結(jié)構(gòu)蛋白 ORF2，選用大腸桿菌（原核）表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備的疫苗在人群中免疫已經(jīng)受了 20多年考驗(yàn)，在安全性上沒有出現(xiàn)過問題。此疫苗再現(xiàn)了 HEV主要中和表位，具有優(yōu)異免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)中和抗體。該團(tuán)隊(duì)闡明了 HEV 中和表位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，成功利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了戊型肝炎病毒顆粒，解決了基因工程疫苗免疫原性偏低的難題，使重組疫苗正式進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。研究前后歷時(shí) 5年，經(jīng)靈長類動(dòng)物保護(hù)性試驗(yàn)和III 期臨床 12 萬名志愿者參加的試驗(yàn)證實(shí)，國產(chǎn)戊型肝炎疫苗安全有效，安全性指標(biāo)達(dá)到美國和歐盟的最高標(biāo)準(zhǔn)。在注射疫苗一年內(nèi)，使用安慰劑的受試者中有 15 人感染了戊型肝炎，而使用疫苗的人中無一人感染病毒。人工免疫后，沒有發(fā)現(xiàn)疫苗有嚴(yán)重毒副作用[17]。該疫苗生產(chǎn)廠房已在福建廈門海滄生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)園完成建設(shè)，一旦獲得國家藥監(jiān)部門批準(zhǔn)，即可組織生產(chǎn)，滿足市場(chǎng)需求。戊型肝炎疫苗在中和表位、類病毒顆粒結(jié)構(gòu)和大腸桿菌表達(dá)工藝等核心環(huán)節(jié)均擁有發(fā)明專利和完整的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)。這種疫苗一旦上市，將成為我國第一個(gè)原創(chuàng)基因工程病毒疫苗，世界上第三個(gè)基因工程疫苗?？鐕呙缟a(chǎn)企業(yè)對(duì)合作開發(fā)該疫苗的國際市場(chǎng)表示了濃厚興趣。

Purcell 等[18]應(yīng)用昆蟲細(xì)胞/桿狀病毒載體表達(dá) ORF2蛋白片段，通過內(nèi)切酶將衣殼蛋白依次進(jìn)行切割，發(fā)現(xiàn)62 kD 和 56 kD 片段保護(hù)性能良好，56 kD 片段也很穩(wěn)定。經(jīng)恒河猴試驗(yàn)，56 kD 重組蛋白制成的疫苗預(yù)防效果良好。葛蘭素-史克公司（GSK）用此重組疫苗在尼泊爾軍隊(duì)近2000 名志愿者中采用雙盲隨機(jī)試驗(yàn)，其中半數(shù)人接種疫苗，半數(shù)人接種安慰劑。疫苗有效率達(dá)到 95.5%，未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。但用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)制成的疫苗以往尚無在人群中免疫的成功報(bào)道。因此，此疫苗要進(jìn)入臨床尚有待時(shí)日。

5 結(jié)語

戊型肝炎是一種急性胃腸道傳染病，又是人畜禽共患的疾病。戊型肝炎的流行與當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)狀況和衛(wèi)生習(xí)慣密切相關(guān)。我國是戊型肝炎高流行區(qū)，加強(qiáng)戊型肝炎的防治工作成為當(dāng)前迫切的任務(wù)，采用切斷傳播途徑為主的綜合性預(yù)防措施可控制該病流行。我國已研制成功高效、安全、具有完整知識(shí)產(chǎn)權(quán)的疫苗，這種疫苗一旦獲得批準(zhǔn)上市，將成為我國第一個(gè)原創(chuàng)基因工程病毒疫苗。人們期待國產(chǎn)疫苗在未來戊型肝炎預(yù)防中發(fā)揮應(yīng)有的作用。

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