丹龍定喘湯對哮喘豚鼠氣道重塑的作用及機制研究

牟德英, 劉小凡

支氣管哮喘是一種以氣道炎癥和氣道重塑為顯著特征的慢性疾病[1,2]。氣道重塑可致哮喘反復發作,是難治性哮喘的重要病理基礎。預防和逆轉氣道重塑被認為是治療支氣管哮喘,尤其是頑固性哮喘的有效途徑。劉小凡教授根據中醫傳統理論結合多年臨床實踐,提出以運脾補腎、活血祛痰法治療哮喘氣道重塑的觀點,并以此立法,組方丹龍定喘湯應用于臨床,療效顯著。本實驗旨在探討丹龍定喘湯(運脾補腎活血祛痰法)對哮喘豚鼠氣道重塑的干預作用,并進一步探討其可能的機制,為拓展本法在哮喘治療中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性豚鼠24只,6～8周齡,體質量200～300 g,由成都中醫藥大學試驗動物中心(許可證號:SCXK(川)2008-11)提供。將豚鼠按體質量分層隨機分為4組:空白對照組、模型對照組、地塞米松組、丹龍定喘湯組,每組6只。

1.2 主要藥品及試劑 丹龍定喘湯(由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供,每毫升相當于生藥1 g),地塞米松針劑(河北天成藥業有限公司),卵蛋白(美國Sigma公司),氫氧化鋁干粉(成都科龍化工試劑廠),轉化生長因子β1(transform ing grow th factor β1,TGF-β1)試劑盒、SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3 哮喘氣道重塑模型制備 依據文獻[3,4]造模。模型對照組、地塞米松組和丹龍定喘湯組豚鼠于第1天腹腔注射抗原混懸液1m L(含生理鹽水加卵蛋白100m g,氫氧化鋁干粉100 mg)致敏。14 d后,用1%卵清蛋白氣霧激發,用霧化器噴入1%卵蛋白生理鹽水20 s,在霧室中自然吸入30 s,以豚鼠腹肌收縮為陽性,每日誘喘1次,共4周。空白對照組給予等量的生理鹽水于相同部位注射和霧化吸入。

1.4 給藥方法 各組均普通喂養。第15天起于每日激發前1 h灌胃給藥,12.5 m L/kg。模型對照組和空白對照組在第15～45天給予等容積生理鹽水灌胃,每日1次;地塞米松組第15～45天給予0.02%地塞米松霧化20min;丹龍定喘湯組第15～45天給予藥液灌胃。

1.5 取材及染色 各組豚鼠分別于末次給藥24 h內稱重,麻醉后斷頭處死,迅速打開胸腔,取豚鼠整個肺臟,稱重記錄后,留取右肺中葉組織,置于10%甲醛加95%乙醇等量混合液中固定,備用于病理檢測。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般狀況觀察 記錄豚鼠的進食、體質量、行為活動等。

1.6.2 肺組織病理學觀察 右肺中葉組織固定24 h后,常規石蠟包埋,切成7μm厚切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織病理學特征。

1.6.3 肺總管支氣管壁面積(WA t)及管腔內周長(Pi)的測定 HE染色后采用圖像分析儀系統進行測定。每只動物選取3個完整支氣管截面在100倍光鏡下用圖像分析軟件測量,取面積、周長、積分光密度3個參數,設定最小目標面積(實際值:5,像素值:5),結果取平均值。根據James等[5]的觀點,氣道在收縮和舒張不同狀態下,其內周長保持不變,故用Pi將WA t值標準化,以WA t/Pi表示支氣管管壁的厚度,反映氣道重塑的程度。

1.6.4 肺支氣管壁平滑肌面積(WAm)的測定 采用Masson三原色染色法,操作嚴格按說明書進行,由病理科專人操作。在多功能真彩色病理圖像分析系統下,采用連接計算機的顯微鏡(100倍),選取3個完整的支氣管截面,取面積、周長、平均光密度、積分光密度、平均黑度5個參數,設定最小目標面積(實際值:5,像素值:5),測量WAm及Pi,結果取其平均值,用Pi將WAm標準化,以 WAm/Pi表示支氣管平滑肌的厚度,反映氣道重塑的程度。

1.6.5 TGF-β1含量的測量 采用SP法免疫組織化學染色法,操作嚴格按SP試劑盒說明書進行,由病理科專人操作。在多功能真彩色病理圖像分析系統下,采用連接計算機的顯微鏡測量。以細胞質清晰棕黃色為陽性,采用圖像分析軟件對 TGF-β1陽性部位進行原位定量檢測,每張切片選用3個視野(×200),自動選取陽性部位并計算相對積分光密度值(integral optical density,IOD)值。取面積、周長、平均光密度、積分光密度、平均黑度5個參數。

1.7 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理,數據用 x±s表示,用單因素方差分析,組間比較采用LSD法(方差齊)或Tamhane法(方差不齊)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物一般表現 空白對照組:進食量隨體質量增加而逐漸增加,活動量正常,體毛順滑有光澤,灌生理鹽水后無明顯不適;模型對照組:經抗原激發后,出現精神萎靡,行動遲緩、毛發失去光澤,呼吸急促,腹肌收縮,活動后氣喘加重;地塞米松組和丹龍定喘湯組:激發后活動量減少,呼吸急促,活動后加劇,毛色有光澤,飲食如常。

2.2 肺組織病理改變 空白對照組無氣道壁增厚,氣道黏膜結構完整,無明顯炎癥反應;模型對照組豚鼠氣道壁明顯增厚且不完整,氣道平滑肌層和網狀基底膜層增厚,氣道黏膜皺襞增多,氣道周圍明顯的炎細胞浸潤,以嗜酸性粒細胞為主;丹龍定喘湯組和地塞米松組豚鼠氣道壁增厚不明顯,氣道黏膜結構較完整,炎癥反應輕微。

2.3 氣道形態學指標及豚鼠支氣管管壁 TGF-β1 IOD值比較 見表1。

表1 各組氣道形態學指標及豚鼠支氣管管壁TGF-β1 IOD 值比較( x±s,n=6,μm)

表1結果說明,模型對照組 WA t/Pi、WAm/Pi均顯著增加,豚鼠肺組織中的 TGF-β1含量增加,與空白對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05),說明模型對照組豚鼠肺支氣管管壁和平滑肌明顯增厚,TGF-β1含量明顯增加。丹龍定喘湯組氣道壁厚度減輕,TGF-β1含量減少,與模型對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05);與地塞米松組相比,差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

支氣管哮喘是當今世界威脅公共健康最常見的慢性疾病之一。全球約有哮喘患者2億[6],近20年內哮喘病的患病率在世界范圍內顯著增加,并且有繼續增加的趨勢[7]。因此,哮喘已成為一種嚴重的公共衛生問題而引起了世界衛生組織、各國政府及臨床醫師的廣泛關注,對哮喘的研究也越來越深入。盡管如此,哮喘的治療仍是一個尚未解決的醫學難題。

氣道重塑是哮喘患者特征性的病理改變[1,2],可導致哮喘反復發作,氣道高反應性進行性加重,肺功能持續下降,氣道不可逆阻塞最終形成,是難治性哮喘的重要病理基礎。預防和逆轉氣道重塑被認為是治療支氣管哮喘,尤其是頑固性哮喘的有效途徑。

對于氣道重塑的治療,西醫尚無確切有效的藥物。目前認為治療哮喘最有效的藥物是糖皮質激素,雖然能抑制炎癥反應、減輕癥狀,但其能否有效防治氣道重塑還存在很大的爭議[8]。并且長期運用激素產生的一系列問題也不容易忽視,如副反應大、激素抵抗、激素依賴等,且吸入劑費用昂貴。因此,積極尋求能有效控制氣道炎癥,抑制氣道重塑,降低氣道高反應性,且毒副反應小的綜合性治療藥物,是當前面臨的一項重大課題。

支氣管哮喘屬于中醫“哮病”范疇,中醫治療哮喘有兩千多年的經驗,中醫藥具有多途徑,多靶點的整體調節優勢,運用中醫藥探索抑制氣道重塑的方法,是哮喘治療的新的發展方向。祖國醫學認為,哮喘發作的主要病理因素是“痰”,故在哮喘治療中運脾除濕以助消痰;瘀血是哮喘反復發作的主要病機之一,以活血化瘀法治療哮喘;同時腎為氣之根,哮喘遷延總不離于腎,強調在哮喘的整個病程中予以補腎藥物治療。丹龍定喘湯充分體現了上述治則,其主藥有丹參、地龍、當歸、熟地、半夏、陳皮、茯苓等。方中丹參功擅活血祛瘀,作用平和,活血而不傷正,《本草便讀》謂其“為調理血分之首藥”;地龍功擅祛風通絡,丹參與地龍相配,起到活血化瘀,通絡平喘的作用。熟地寒潤滋腎,“為壯水之圣藥”,當歸溫潤補血,為血中氣藥,當歸與熟地相合,補肺益腎,金水相生,以固其本;當歸與丹參相配,可增強活血化瘀的功效。二陳湯為治療濕痰之要方。諸藥相合,肺腎同治,痰瘀并調,正氣得固,邪氣得除,喘咳自止。

目前認為氣道重塑是指氣道在慢性炎癥反復不斷刺激下所發生的氣道壁結構變化,包括氣道平滑肌細胞增生和肥大,細胞外基質(膠原)沉積、基底膜增厚,炎癥細胞浸潤和腺體增生肥大,是哮喘氣道病理改變的重要基礎[9]。本實驗顯示,光鏡下哮喘模型組氣道平滑肌明顯增厚,肺泡壁普遍增厚,氣道形態學檢測結果也表明,哮喘豚鼠支氣管平滑肌層顯著增厚,整個支氣管壁顯著增厚,符合氣道重塑的病理學改變。而丹龍定喘湯的干預能顯著阻斷這種氣道壁增厚的趨勢,提示運脾補腎活血祛痰中藥能有效抑制哮喘豚鼠的氣道重塑。

TGF-β是近年來發現的一個具有多種生物學功能的細胞生長因子家族,是具有強烈致纖維化的細胞因子,它誘導的凋亡反應是引起肺纖維化的前提,近年的研究表明TGF-β在哮喘的發病過程中與上皮炎癥損傷后的修復過程及氣道重塑密切相關[10]。抑制TGF-β1的表達可能阻止或減輕哮喘的氣道重塑。研究發現,哮喘患者支氣管黏膜活檢標本中表達的TGF-β較正常人顯著增多,且TGF-β與基底膜和成纖維細胞數量明顯相關[11]。本實驗免疫組織化學染色結果顯示,哮喘模型組豚鼠肺組織中的 TGF-β1含量顯著增多,證實了 TGF-β1在哮喘氣道重塑中發揮重要作用,TGF-β1過度表達是導致氣道重塑的重要因素。而經丹龍定喘湯治療后,哮喘豚鼠肺組織中TGF-β1含量顯著減少,提示運脾補腎活血祛痰中藥作用于氣道重塑的可能機制是通過下調豚鼠肺組織中的TGF-β1的水平,抑制氣道平滑肌細胞及細胞外基質的增殖,從而阻止氣道重塑的進程。

中醫藥在防治哮喘方面有著豐富的臨床經驗和確切的臨床療效,但其研究多數停留在臨床觀察與癥狀描述方面。本次研究探討了運脾補腎活血祛痰中藥對哮喘模型氣道重塑的干預作用,并初步揭示其可能的作用機制,為運脾補腎活血祛痰中藥在哮喘治療中的應用奠定了理論基礎。并進一步提示今后可繼續以氣道重塑為切入點,發揮中醫藥的優勢,在哮喘防治中走出中國獨特的道路。

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