腫瘤抗原細胞毒性T淋巴細胞表位鑒定和多肽疫苗的研究進展*

吳亞紅，高艷鋒，祁元明

鄭州大學生物工程系鄭州450001

(2011-07-05收稿 責任編輯 姜春霞)

惡性腫瘤是當前威脅人類生命健康的主要疾病之一，盡管手術(shù)治療聯(lián)合化療/放療能夠延長患者的生存期，但是這些治療手段也會損傷正常細胞，產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，再加上很多惡性腫瘤具有侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特征，因此，急需發(fā)展新的方法來治療腫瘤患者［1］。隨著人們對免疫系統(tǒng)及其調(diào)節(jié)方式的逐漸認識，腫瘤的免疫治療已成為傳統(tǒng)療法的必要補充，由于其不良反應(yīng)小，且能在機體內(nèi)建立免疫記憶，因此引起了人們的廣泛關(guān)注。細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)介導的特異性細胞免疫在抗腫瘤免疫過程中發(fā)揮著主要作用。CTL不僅能通過顆粒酶和穿孔素等物質(zhì)直接殺傷腫瘤細胞，還可以通過分泌一些細胞因子如IFN-γ和TNF-α等間接地殺傷腫瘤細胞［2］。T細胞特異性活化的第一步是其表面的 T細胞受體(Tcellreceptor，TCR)與存在于腫瘤細胞或抗原提呈細胞(antigenpresentingcell，APC)表面的抗原肽-MHC(人類MHC稱為HLA)復(fù)合物的特異性結(jié)合，即T細胞所識別的是腫瘤特異性抗原或相關(guān)抗原中能與相應(yīng)的HLA分子槽狀結(jié)合部位相匹配的稱為抗原表位的小肽片段。因此，尋找能夠激活腫瘤特異性CTL的抗原肽表位一直是該領(lǐng)域的研究熱點和前沿課題。研究［3］表明，腫瘤細胞表面的抗原肽能夠有效地誘導針對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，且抗原肽為基礎(chǔ)的疫苗具有一些獨特的優(yōu)勢，比如結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物相對簡單、化學性質(zhì)穩(wěn)定、安全性高、成本低和制備方便等，此外表位肽還可以通過修飾來提高免疫原性，包括形成多表位疫苗或引入非天然的氨基酸，因此抗原肽疫苗是腫瘤免疫治療的理想候選。但是如何篩選更特異性的腫瘤抗原、提高抗原肽的免疫原性以及選擇更好的佐劑及載體仍然是發(fā)展抗原肽疫苗亟待解決的問題。該文主要就CTL表位肽相關(guān)研究的策略和進展進行闡述。

1 腫瘤抗原

腫瘤抗原是對細胞癌變過程中出現(xiàn)的新抗原物質(zhì)的總稱。這些物質(zhì)中的蛋白質(zhì)被降解后產(chǎn)生的一些肽段能夠與MHC分子結(jié)合，并提呈到細胞表面，成為CTL識別殺傷的靶點［4］。根據(jù)腫瘤抗原特異性的程度將腫瘤抗原分為兩大類:一類是只存在于腫瘤細胞中而不存在于正常細胞中的腫瘤特異性抗原(tumorspecificantigen，TSA);另一類是在腫瘤細胞、正常組織及細胞中均存在，但在腫瘤時期含量明顯增加的腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociatedantigen，TAA)。目前已經(jīng)有2000種以上的腫瘤抗原被鑒定。

TSA主要包括:①癌睪抗原(cancer-testisantigen，CT 抗原)［5-6］:此類抗原只在睪丸、胚胎等免疫豁免器官和腫瘤組織中表達而在其他正常組織中不表達，因此，也被認為是腫瘤特異性共享抗原。目前已經(jīng)有超過100個基因家族的CT抗原被鑒定出來，并建立了CT抗原數(shù)據(jù)庫CTDatabase(http://www.cta.lncc.br/)，可以查閱目前為止發(fā)現(xiàn)的所有CT抗原的信息。一些針對CT抗原的治療性癌癥疫苗已經(jīng)進入Ⅱ/Ⅲ期的臨床試驗，包括MAGE-A3和NY-ESO-1等，它們是腫瘤免疫治療的理想靶點［7］。②基因突變產(chǎn)生的抗原:此類抗原也是一類潛在的腫瘤抗原，在患者和動物模型中這些突變都可能誘導產(chǎn)生針對腫瘤的特異性CTL，啟動免疫應(yīng)答。比如突變的 p53［8］、p21/ras和 β-catenin 等，以p53為靶點的腫瘤免疫治療疫苗已經(jīng)進入臨床試驗階段。③病毒基因編碼的抗原:人類一些惡性腫瘤與某些特定的病毒感染疾病相關(guān)，如人乳頭瘤病毒(HPV)［8］和乙型肝炎病毒(HBV)等。此類抗原在相關(guān)的腫瘤組織中表達，可以作為預(yù)防型和治療型疫苗的理想靶點。④剪切不同產(chǎn)生的抗原:如何杰金淋巴瘤組織中的 restin［9］。

大多數(shù)TAA只是表現(xiàn)在表達量的變化，沒有嚴格的腫瘤特異性，最為常見的是過表達抗原。研究較多的有MelanA和HER-2/neu等［10］。

過去尋找腫瘤抗原最常用的是免疫學方法，如T細胞表位克隆技術(shù)和cDNA表達文庫的血清學分析方法(SEREX)［11］。近幾年發(fā)展起來了一些高通量的基因表達分析方法使得發(fā)現(xiàn)新腫瘤抗原的速度大大加快，如cDNA芯片分析、基因表達連續(xù)性分析和大規(guī)模平行信號測序等方法。

2 表位預(yù)測

腫瘤特異性免疫治療的前提是尋找有效的CTL表位，而CTL表位的快速篩選和鑒定又是CTL表位疫苗研究的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的表位鑒定方法如利用酸性條件從腫瘤細胞表面洗脫和鑒定抗原肽及合成大量的重疊肽，然后進行表位鑒定，這些方法既費時又費力。自從基于“反向免疫學”理論的免疫信息學表位預(yù)測方法出現(xiàn)之后，對抗原表位進行預(yù)測成為表位鑒定的有效工具［12］，通過表位預(yù)測不僅能提高表位鑒定的效率，還能夠減少合成和活性實驗的工作量，節(jié)約研究經(jīng)費。

當前CTL表位預(yù)測方法的發(fā)展很快，已經(jīng)不僅僅局限于單純的MHC分子和抗原肽親和力的預(yù)測，很多軟件也加入了蛋白酶體裂解位點預(yù)測、TAP轉(zhuǎn)運效率預(yù)測和抗原肽空間結(jié)構(gòu)預(yù)測等手段，且綜合運用多種預(yù)測方法大大提高了預(yù)測的準確度。目前運用最多的預(yù)測軟件有NetCTL軟件、SYFPEITHI軟件、BIMAS預(yù)測軟件、IEDB預(yù)測軟件和EpiJen軟件等［13］。人們已經(jīng)運用這些軟件篩選鑒定了多種有作用的抗原表位。

近年來人們綜合運用矩陣打分、支持向量機(SVM)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)等方法將表位預(yù)測的準確度進一步提高。相信隨著蛋白質(zhì)預(yù)測技術(shù)的不斷創(chuàng)新，對CTL表位預(yù)測的準確度將大大提高。

3 表位鑒定

對抗原表位的預(yù)測能夠?qū)崿F(xiàn)對表位的初步篩選，然而，目前大多數(shù)軟件的預(yù)測準確率不高，因此，對表位的鑒定必須依賴后續(xù)的一系列實驗。通常包括以下步驟:①合成預(yù)測獲得的表位肽，通過高效液相色譜(HPLC)或其他手段對表位肽進行分析純化，通過質(zhì)譜等手段對表位肽進行物化性質(zhì)鑒定。②通過親和力實驗檢測表位肽與MHC分子的親和力及形成的MHC/肽復(fù)合物的穩(wěn)定性［14］，篩選得到親和力以及穩(wěn)定性較高的表位直接進行后續(xù)的活性研究，對親和力和(或)穩(wěn)定性較低的表位可以進行結(jié)構(gòu)改造獲得表位肽類似物進行后續(xù)實驗［15-16］。③檢測待測表位在健康志愿者和腫瘤患者的外周血單個核細胞(PBMC)中誘導產(chǎn)生CTL的能力［17］，通常進行ELISPOT實驗或者采用細胞內(nèi)染色的方法檢測CTL分泌細胞因子的能力，通過細胞毒性實驗(如Cr51或LDH釋放實驗)檢測誘導產(chǎn)生的CTL對腫瘤細胞的殺傷狀況。④檢測待測表位體內(nèi)誘導產(chǎn)生CTL的能力以及獲得的CTL對腫瘤細胞的殺傷狀況。通常采用HHD轉(zhuǎn)基因小鼠［18］或HLA-A2.1/Kb轉(zhuǎn)基因小鼠模型［19］進行研究。⑤建立荷瘤模型［20］，檢測體內(nèi)外誘導產(chǎn)生的CTL對實體瘤的殺傷作用。通常會建立預(yù)防型腫瘤模型和治療型腫瘤模型來研究抗原表位的作用。目前作者的研究組［21-22］也已經(jīng)通過以上方案鑒定出一些具有明顯抗腫瘤活性的抗原表位。

4 腫瘤抗原肽疫苗的研究進展

從1990年發(fā)現(xiàn)第一個TAA開始，抗原肽疫苗的概念就為癌癥治療提供了理想的模式，旨在誘導獲得治療性CD8+T細胞反應(yīng)的合成肽疫苗經(jīng)歷了很長時間的狂熱階段，人們在抗原肽疫苗的設(shè)計、合成和轉(zhuǎn)運方面做了很多的改進，也鑒定獲得了相當數(shù)量的抗原肽疫苗。目前已經(jīng)有多種抗原肽疫苗進入了臨床試驗，如來自于 HER-2/neu、MAGE-A3、MART-1、TRP-2、gp100 和 NY-ESO-1 等抗原的單個或混合表位肽疫苗均有較多的研究［23］。

盡管抗原肽疫苗在動物模型中取得了很好的效果，但是在臨床上獲得的效果卻極其有限［24］。因為腫瘤抗原是自身抗原，會對機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生耐受，因此自身抗原的免疫原性通常較低，所以就需要改善腫瘤抗原的免疫原性。目前常用的方法有:①改變抗原肽錨定位點的氨基酸殘基來增強它們與MHC分子的親和力，同樣也能在不產(chǎn)生自身免疫的情況下增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，已經(jīng)在一些動物模型［15］中得到了驗證。②對MHC錨定位點以外的與TCR接觸位點的氨基酸殘基進行不規(guī)則的替換，所產(chǎn)生的表位能夠更有效地刺激T細胞的活化，而且它們能夠打破免疫耐受。③引入非天然氨基酸來改善與MHC的結(jié)合和對TCR的激活特性，增強體內(nèi)作用的半衰期。④將表位肽環(huán)化來降低被蛋白酶降解的幾率，延長半衰期和穩(wěn)定性，改變構(gòu)象增加與受體的結(jié)合和改善免疫活性。⑤延長表位肽疫苗的氨基酸序列，獲得可能同時包含CTL表位和Th表位，或包含多個CTL表位的長肽［25］，不僅能夠提高免疫原性，也能夠提升免疫反應(yīng)的強度。⑥通過分枝多肽的方法構(gòu)建獲得來源于一個或多個腫瘤抗原的小的CTL表位或Th表位的多表位疫苗［26］。

在誘導免疫的過程中，T細胞產(chǎn)生耐受的另外一方面是缺乏共刺激信號或危險信號。借助共刺激信號的幫助且刺激得當?shù)脑?，APC尤其是樹突狀細胞(DC)能夠被成功地激活，擴增并引導T細胞向腫瘤部位遷移。佐劑是一類能夠增強抗原免疫原性的物質(zhì)，目前已經(jīng)在癌癥疫苗中得到了應(yīng)用，很多佐劑除了能夠增強免疫刺激以外，也可以以“油包水”的狀態(tài)作為疫苗的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)起作用。目前，一些新型的佐劑主要集中在增強體液免疫反應(yīng)以及對模式識別受體和共刺激分子等的調(diào)節(jié)方面。此外，為了增加抗原肽疫苗在臨床上成功的機會，精確地選擇治療的模式和時間點非常重要。

5 展望

盡管人們通過多種方法來改善腫瘤抗原肽疫苗的效果，但是到目前為止它們在臨床患者中的抗腫瘤療效還是比較有限的，通過對臨床試驗結(jié)果的分析，今后有可能在以下方面進行進一步的研究和改進:①鑒定那些參與腫瘤細胞增殖/存活的腫瘤抗原以及腫瘤干細胞中表達的腫瘤抗原，以它們?yōu)榘悬c有可能對抗腫瘤細胞的抗原下調(diào)和清除其中的腫瘤干細胞。②鑒定發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤類型中均具有較高表達水平和抗原性的腫瘤抗原來誘導針對多種內(nèi)源性腫瘤抗原的免疫反應(yīng)。③改善APC對抗原加工和提呈的能力，包括使用佐劑。④通過多表位疫苗的構(gòu)建，改善CTL和Th在體內(nèi)擴增的能力。⑤了解癌癥產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)的機制，打破機體對腫瘤的免疫耐受狀態(tài)，尤其是針對腫瘤微環(huán)境中的一些抑瘤信號途徑、細胞因子和負性共刺激分子為靶點進行腫瘤免疫治療。⑥在治療的時機上，更好地與放化療進行配合。此外，以預(yù)防為主的腫瘤抗原肽疫苗在誘導抗腫瘤反應(yīng)中是極其有效的，可能具有更好的應(yīng)用前景。隨著抗原肽疫苗的不斷改進，它必將會成為治療腫瘤的一種重要手段。

［1］ Naz RK，Dabir P.Peptide vaccines against cancer，infectious diseases，and conception［J］.Front Biosci，2007，12:1833

［2］ Kawakami Y.Cancer treatment by comprehensive regulation of anti-tumor immune network［J］.Nihon Rinsho，2010，68(6):1094

［3］Khazaie K，Bonertz A，Beckhove P.Current developments with peptide-based human tumor vaccines［J］.Curr Opin Oncol，2009，21(6):524

［4］ Beck A，Klinguer-Hamour C，Bussat MC，et al.Peptides as tools and drugs for immunotherapies［J］.J Pept Sci，2007，13(9):588

［5］ Caballero OL，Chen YT.Cancer/testis(CT)antigens:potential targets for immunotherapy［J］. Cancer Sci，2009，100(11):2014

［6］ Almeida LG，Sakabe NJ，deOliveira AR，et al.CTdatabase:a knowledge-base of high-throughput and curated data on cancer-testis antigens［J］.Nucleic Acids Res，2009，37(Database issue):D816

［7］ Bao L，Dunham K，Lucas K.MAGE-A1，MAGE-A3，and NY-ESO-1 can be upregulated on neuroblastoma cells to facilitate cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor cell killing［J］.Cancer Immunol Immunother，2011 May 28［Epub ahead of print］

［8］ Reuschenbach M，Waterboer T，Wallin KL，et al.Characterization of humoral immune responses against p16，p53，HPV16 E6 and HPV16 E7 in patients with HPV-as-sociated cancers［J］.Int JCancer，2008，123(11):2626

［9］ Gardiner J，Overall R，Marc J.Putative Arabidopsis homologues of metazoan coiled-coil cytoskeletal proteins［J］.Cell Biol Int，2011，35(8):767

［10］Sahoo R，Babu VC，Harini VV，et al.Her-2/neu overexpression due to polysomy 17 in breast cancer:molecular testing to guide therapeutic options［J］.Onkologie，2011，34(7):356

［11］Tan HT，Low J，Lim SG，et al.Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection［J］.FEBS J，2009，276(23):6880

［12］Lundegaard C，Lund O，Buus S，et al.Major histocompatibility complex class I binding predictions as a tool in epitope discovery［J］.Immunology，2010，130(3):309

［13］Doytchinova IA，Guan P，F(xiàn)lower DR.EpiJen:a server for multistep T cell epitope prediction［J］.BMC Bioinformatics，2006，7:131

［14］Lekka E，Gritzapis AD，Perez SA，et al.Identification and characterization of a HER-2/neu epitope as a potential target for cancer immunotherapy［J］.Cancer Immunol Immunother，2010，59(5):715

［15］Li F，Yang D，Wang Y，et al.Identification and modification of an HLA-A*0201-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from Ran antigen［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(12):2039

［16］Croft NP，Purcell AW.Peptidomimetics:modifying peptides in the pursuit of better vaccines［J］.Expert Rev Vaccines，2011，10(2):211

［17］Inoue M，Senju S，Hirata S，et al.Identification of SPARC as a candidate target antigen for immunotherapy of various cancers［J］.Int JCancer，2010，127(6):1393

［18］Gritzapis AD，F(xiàn)ridman A，Perez SA，et al.HER-2/neu(657-665)represents an immunogenic epitope of HER-2/neu oncoprotein with potent antitumor properties［J］.Vaccine，2009，28(1):162

［19］Liu W，Zhai M，Wu Z，et al.Identification of a novel HLA-A2-restricted cytotoxic T lymphocyte epitope from cancer-testis antigen PLAC1 in breast cancer［J］.Amino Acids，2011 Jun 28［Epub ahead of print］

［20］Gritzapis AD，Voutsas IF，Lekka E，et al.Identification of a novel immunogenic HLA-A*0201-binding epitope of HER-2/neu with potent antitumor properties［J］.J Immunol，2008，181(1):146

［21］Gao YF，Sun ZQ，Qi F，et al.Identification of a new broad-spectrum CD8+T cell epitope from over-expressed antigen COX-2 in esophageal carcinoma［J］.Cancer Lett，2009，284(1):55

［22］Lv H，Gao Y，Wu Y，et al.Identification of a novel cytotoxic T lymphocyte epitope from CFP21，a secreted protein of Mycobacterium tuberculosis［J］.Immunol Lett，2010，133(2):94

［23］Amadori D，Milandri C，Comella G，et al.A phaseⅠ/Ⅱtrial of non-pegylated liposomal doxorubicin，docetaxel and trastuzumab as first-line treatment in HER-2-positive locally advanced or metastatic breast cancer［J］.Eur JCancer，2011 Jun 10［Epub ahead of print］

［24］Claesson MH.Why current peptide-based cancer vaccines fail:lessons from the three Es［J］.Immunotherapy，2009，1(4):513

［25］Melief CJ，van der Burg SH.Immunotherapy of established(pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines［J］.Nat Rev Cancer，2008，8(5):351.A

［26］Wang H，Su X，Zhang P，et al.Recombinant heat shock protein 65 carrying PADRE and HBV epitopes activates dendritic cells and elicits HBV-specific CTL responses［J］.Vaccine，2011，29(12):2328