細胞抽提物重編程作用的研究進展

唐新杰 綜述 謝峰 張群 審校

細胞在發育過程中，特異性地開放或者關閉某些特定基因，可以使細胞產生不同的表觀狀態。實驗證明，通過重編程成熟體細胞的基因形態可以使其表觀狀態發生改變，也就是說分化的體細胞在特定的條件下能轉為另一種細胞形態，此過程被稱為體細胞的重編程。細胞抽提物誘導是重編程的方法之一，是指用供體細胞抽提物（Cell extract）作用于受體細胞后，使受體細胞表達供體細胞的特異性基因。本文就細胞抽提物重編程的研究現狀、相關機理及存在的問題進行綜述。

1 細胞抽提物重編程概述

1.1 細胞抽提物重編程的方法

重編程的方法有多種，如核移植[1-3]、細胞融合[4-5]、分子調控誘導[6-8]以及細胞抽提物誘導等。經典的重編程是將供體細胞核轉入卵細胞內，利用卵細胞的胞內微環境對供體細胞基因表達進行重編程，從而使新細胞獲得全能分化性，著名的克隆實驗就屬于重編程。這種重編程效率極低、有卵細胞依賴性、涉及倫理問題等，無法廣泛應用。細胞融合是將體細胞同胚胎干細胞 （Embryonic stem cell，ESCs）或胚胎生殖細胞（Embryonic germ cells，EGCs）融合后，使之轉化為全能細胞，但有效率僅為0.1%～0.3%[9]。分子調控誘導同樣也可對細胞進行重編程，如聯合應用Oct4、Sox2、c-Myc和 Klf4等基因可以誘導體細胞向多能狀態分化，染色體結構發生改變，并表達多能性基因[6]。

細胞抽提物重編程的操作方法是一種比較直接的有效方法。與經典的重編程不同，首先收集供體細胞，加入細胞裂解液，然后在脈沖超聲的作用下勻漿，直至顯微鏡下觀察不到細胞結構和細胞核結構，離心后的上清液即是供體細胞的胞漿、胞核抽提物。接下來，用鏈球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）對受體細胞進行滲透化處理，使其胞膜出現可逆性通道。SLO對黏附和非黏附細胞均具有成孔毒性，處理過的細胞允許小于100 KDa的分子進入細胞[10]。隨后，在抽提物與受體細胞的混合物中加入ATP生成系統和合成RNA所需的各種核苷酸NTP后，使抽提物能夠進入受體細胞的細胞核。最后用含Ca2+的培養液封閉受體細胞膜通道，繼續培養細胞，使其生長、擴增，并表達供體細胞表型。其中，供體細胞抽提物的成分包括細胞質和細胞核的可溶解成分，不包括染色質。

2002年，Hakeline等[12]首次報道應用此技術將T細胞的抽提物轉入成纖維細胞內，發現重編程后的成纖維細胞的組蛋白H4乙酰化，染色體結構發生改變，并表達淋巴細胞特有的基因和表面分子標志，在CD3的刺激下，可以合成白細胞介素2（Interleukin-2，IL-2），這是T細胞特有的反應。同時，報道了應用神經元前體細胞的抽提物，成功使成纖維細胞生長出樹突狀結構，并表達神經纖維蛋白。

1.2 重編程受體細胞的選擇

目前，受體細胞主要是成纖維細胞和成體干細胞，因為這些細胞在體內儲量豐富、取材方便、易于分離培養，而且體外誘導條件下都表現出多向分化潛能，都可以分化為脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞等[13-16]，這為體細胞重編程后的分化提供了理論支持。最近有研究表明，在特定的轉錄因子誘導下，角質形成細胞比成纖維細胞更容易去分化為多能干細胞，有效率約為成纖維細胞的100倍，且角質形成細胞重編程后的細胞的生長速度是成纖維細胞的2倍[17]。在抽提物對體細胞的重編程中，角質形成細胞是否具有同樣的優勢，尚待研究證明。

2 細胞抽提物重編程的作用機理

細胞抽提物重編程的機理尚不明確。目前普遍認為是供體細胞抽提物中的某些物質啟動了受體細胞中某些特異性基因的轉錄控制基因[18]，從而使受體細胞重編程為供體細胞。Hakelien等[12]認為抽提物中的有效成分可能是轉錄因子或者DNA結合蛋白，實驗證明，無論在T淋巴細胞對成纖維細胞的重編程，還是在胰島B細胞抽提物對成纖維細胞的重編程，均觀察到細胞核對相應IL2基因或Ins基因轉錄因子的攝取。而且，熱處理過的抽提物均沒有重編程能力[9，12，18]。

目前的實驗研究中都出現了目的基因啟動子上的組蛋白H3、H4的乙酰化和（或）甲基化狀態及DNA的甲基化狀態的改變。細胞DNA的CpG部位甲基化后可抑制多能性胚胎基因表達，是促進細胞的分化和生長的必備環節，ESCs抽提物處理成纖維細胞后，80%的CpG部位發生去甲基化[20]。目的基因啟動子上的組蛋白H3、H4的乙酰化增強和甲基化減弱[9，18-21]，但有研究表明這種改變是暫時的[20]。 眾所周知，RNA聚合酶Ⅱ結合至啟動子是轉錄起始的關鍵。組蛋白結構的變化引起細胞的染色質結構發生改變，從而募集RNA聚合酶Ⅱ結合至染色體上多能性基因的轉錄調節部位，進一步轉錄出多種相關基因。

細胞抽提物重編程方法表明，分化的細胞在特定的條件下能分化為另一種細胞形態，同時表明細胞重編程后未必回歸胚胎狀態，而是能直接賦予細胞以新的形態。以往觀察到的轉錄因子的改變或者DNA結合蛋白的改變，可能是重編程的始動因素，也可能是重編程復雜環節中的一環。目前，細胞質內物質（如線粒體等）對細胞遺傳分化的影響逐漸成為研究熱點[22-25]。體細胞重編程的始動物質、重編程的機制等問題尚無明確答案。但是，細胞抽提物的重編程模式已被證實是一種有效模式，抽提物可以直接進入受體細胞，而且含有重編程所必須的物質，在不了解機理的前提下，仍然可以進行高效重編程。

3 細胞抽提物重編程作用的研究現狀

Gaustad等[19]用大鼠心肌細胞抽提物處理人脂肪干細胞，3周后，40%的脂肪干細胞變成多核細胞，在培養過程中觀察到細胞有自動節律性。同時，部分細胞表達α-肌動蛋白、連接蛋白43、肌鈣蛋白等心肌細胞特有的表面蛋白，并表達分化細胞特有的核纖層蛋白A/C（Lamin A/C）。此外，在重編程過程中，處于G1期的細胞數量減少，細胞的增殖能力減弱。Hakelien等[18]將胰島素瘤INS-1E細胞提取物轉入滲透化處理過的成纖維細胞,成纖維細胞變為圓形，胞體和核變小。Insulin、Pdx1基因的表達在培養早期可檢測到，維持7～9 d后表達減弱直至消失。用胰島素抗體可以檢測到細胞內胰島素蛋白的出現。但在葡萄糖的刺激下，細胞沒有出現胰島素分泌現象。Bru等[20]用小鼠胚胎干細胞抽提物轉入人293T細胞。Lamin A/C逐漸消失，1～8 h后表達干細胞特有的與多能性相關的基因 Nanog、Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，這些基因的表達在培養過程中持續表達并逐漸加強，說明基因可以發生長期重編程。培養48 h后這些基因表達的強度與ESCs相差較多，表明ESCs的抽提物啟動了293T細胞向多能性狀態的改變，但是沒有完全分化為ESCs。Rajasingh等[9]將小鼠的ESCs抽提物轉入成纖維細胞中，3 d后成纖維細胞的形態開始向ESCs變化，10 d時即形成ESCs樣克隆；4周后，重編程的細胞高效表達 Oct4、Nanog、SSEA1、SCF 和 c-Kit等 ESCs標志物，并且在體外誘導條件下，細胞可以向心肌細胞、內皮細胞、神經元細胞和脂肪細胞分化。將CM-DiI標記的重編程后的細胞應用至小鼠下肢缺血模型，術后7 d、10 d、14 d觀察，缺血下肢的灌注明顯增強，毛細血管密度顯著增加，移植的細胞分化為血管內皮細胞和骨骼肌細胞。應用攜帶GFP基因的慢病毒轉染重編程的細胞后，對急性心肌梗死小鼠進行心肌注射后發現心肌纖維化部位明顯減少，左心室無顯著擴張，心肌收縮功能較好，梗死部位邊緣組織的毛細血管密度明顯增加，移植的細胞轉化為心肌細胞和血管內皮細胞。

4 細胞抽提物重編程目前存在的問題及應用前景

4.1 重編程的有效率

根據文獻說明，細胞抽提物重編程的最高的有效率為90%[12]，但是在重編程過程中需要連續更換多種試劑和培養液，這樣就導致增殖細胞的選擇性培養，無法準確估計重編程細胞的比例。而且，長期的培養過程使得系統分析與重編程有關的因子及作用的難度增大。因此，以簡單高效的方法來實現細胞抽提物重編程，是需要進一步研究的。

4.2 新基因表型的維持

在抽提物處理細胞后，8 h內即可檢測出目的基因的表達[20]。目的基因的表達會在高峰期開始下降。有文獻表明，重編程數月后還可以檢測到新表型的表達[11]，新表型的維持時間與受體細胞的類型和抽提物的來源有關。如何使重編程后的細胞最大化且持久地維持新表型，是今后研究的重點方向之一。

4.3 重編程后的細胞與目的細胞的差異性

重編程受多種因素的影響，如細胞所處的環境變化、周圍組織細胞分泌的因子的影響、受體細胞自身的可調節性等。目前，尚無證據表明重編程的細胞可以分化至與供體細胞完全相同的形態，在某些基因的表達上，兩者存在明顯的差異[20]。所以，需要探索新的實驗方法來調節受體細胞，使其達到完全轉分化或者去分化狀態。但也有學者認為，重編程無需達到完全重編程狀態，只要可以具有需要的功能即可。例如受體細胞轉分化為胰島B細胞，只要具有胰島素分泌能力即可，無需完全轉分化為胰島B細胞[27]。

綜上所述，在細胞抽提物的重編程過程中，細胞抽提物制備過程簡單，可以通過濃縮達到一定有效濃度以保存使用。轉入到患者自體的受體細胞內，改變患者自體的受體細胞的表型及功能，使其轉變為治療疾病所需要的細胞，這樣獲得的細胞可以避免免疫排斥反應，且不會造成大的創傷。重編程技術可以應用于多種細胞，可為組織工程化組織構建提供種子細胞，在組織器官的修復重建領域將具有廣闊的應用前景。

[1]Wilmut I,Schnieke AE,McWhir J,et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells[J].Nature,1997,385(6619):810-813.

[2]Wakayama T,Perry AC,Zuccotti M,et al.Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei[J].Nature,1998,394(6691):369-374.

[3]Gurdon JB,Byrne JA.The first half-century of nuclear transplantation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(14):8048-8052.

[4]Do JT,Han DW,Scholer HR.Reprogramming somatic gene activity by fusion with pluripotent cells[J].Stem Cell Rev,2006,2(4):257-264.

[5]Tada M,Takahama Y,Abe K,et al.Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells[J].Curr Biol,2001,11(19):1553-1558.

[6]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[7]Aoi T,Yae K,Nakagawa M,et al.Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells[J].Science,2008,321(5881):699-702.

[8]Park IH,Zhao R,West JA,et al.Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors[J].Nature,2008,451(7175):141-146.

[9]Rajasingh J,Lambers E,Hamada H,et al.Cell-free embryonic stem cell extract-mediated derivation of multi-potent stem cells from NIH3T3 fibroblasts for functional and anatomical ischemic tissue repair[J].Circ Res,2008,102(11):e107-117.

[10]Walev I,Bhakdi SC,Hofmann F,et al.Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(6):3185-3190.

[11]Collas P,Taranger CK.Epigenetic reprogramming of nuclei using cell extracts[J].Stem Cell Rev,2006,2(4):309-317.

[12]Hakelien AM,Landsverk HB,Robl JM,et al.Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts[J].Nat Biotechnol,2002,20(5):460-466.

[13]Mizuno H.Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration:ten years of research and a literature review[J].J Nippon Med Sch,2009,76(2):56-66.

[14]Yates KE,Mizuno S,Glowacki J.Early shifts in gene expression during chondroinduction of human dermal fibroblasts[J].Exp Cell Res,2001,265(2):203-211.

[15]饒寒敏,徐榮輝.成纖維細胞成骨潛能的體外培養研究[J].中華骨科雜志,1995,15(12):845-848.

[16]Liu S,Wang L,Wang N,et al.Oleate induces transdifferentiation of chicken fibroblasts into adipocyte-like cells[J].Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol,2009,154(1):135-141.

[17]Aasen T,Raya A,Barrero MJ,et al.Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes[J].Nat Biotechnol,2008,26(11):1276-1284.

[18]Hakelien AM,Gaustad KG,Collas P.Transient alteration of cell fate using a nuclear and cytoplasmic extract of an insulinoma cell line[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,316(3):834-841.

[19]Gaustad KG,Boquest AC,Anderson BE,et al.Differentiation of human adipose tissue stem cells using extracts of rat cardiomyocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,314(2):420-427.

[20]Bru T,Clarke C,McGrew MJ,et al.Rapid induction of pluripotency genes after exposure of human somatic cells to mouse ES cell extracts[J].Exp Cell Res,2008,314(14):2634-2642.

[21]Miyamoto K,Furusawa T,Ohnuki M,et al.Reprogramming events of mammalian somatic cells induced by xenopus laevis egg extracts[J].Mol Reprod Dev,2007,74(10):1268-1277.

[22]Liu L,Keefe DL.Cytoplasm mediates both development and oxidation-induced apoptotic cell death in mouse zygotes[J].Biol Reprod,2000,62(6):1828-1834.

[23]Takeda K,Tasai M,Iwamoto M,et al.Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes[J].Biol Reprod,2005,72(6):1397-1404.

[24]Cummins JM.Mitochondria:potential roles in embryogenesis and nucleocytoplasmic transfer[J].Hum Reprod Update,2001,7(2):217-228.

[25]Surani MA.Reprogramming of genome function through epigenetic inheritance[J].Nature,2001,414(6859):122-128.

[26]Collas P.Nuclear reprogramming in cell-free extracts[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci,2003,358(1436):1389-1395.