PCR技術的發展及其在煙草中的應用

李 林，陳 武，周清明，黎定軍

(1 湖南農業大學農學院，長沙 410128；2 湖南農業大學生物安全科技學院，長沙 410128；3 湖南廣播電視大學，長沙 410004)

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶鏈式反應， 是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。現已被廣泛應用于農學、植物病理學等領域的研究。最初的PCR技術相當不成熟，但在隨后的幾十年里，PCR技術被不斷改進，它從一種定性的分析方法發展到定量測定；從原先只能擴增幾個 kb的基因到目前已能擴增長達幾十個 kb的DNA片段[1]。到目前為止，PCR技術已有十幾種之多，本文對其近年來的主要擴展及應用進行綜述。

1 PCR技術的擴展

1.1 AP-PCR技術

1.1.1 AP-PCR技術的定義、來源及特點

AP-PCR(Arbitrarily primed PCR)技術[2]，是指在對所擴增基因順序一無所知的情況下，主觀上隨意地設計或選擇一個非特異引物進行PCR擴增，反應在不嚴格條件下擴增1至數輪后，再于嚴格條件下進行。通過比較擴增產物的指紋圖，即可反映出待分析基因組的特征。AP-PCR 技術由 Williams等[3]于20世紀90年代建立，它可以快速地從兩個或更多的個體組織細胞中分離出差異基因或基因差異表達產物，具有簡單、靈敏、有效和重復性好等特點。

1.1.2 AP-PCR技術的應用

AP-PCR技術是常規PCR技術在差異基因分離方面的擴展，主要應用在：(1)差異基因的分離，Liang和Pardee[2]應用AP-PCR技術對正常A31和腫瘤起源的BPA31細胞進行了鑒定，并分離得到了僅存在于正常細胞的N1及僅存在于腫瘤細胞的T1片段；(2)菌株鑒定，楊國玲等[3]采用AP-PCR技術對甲真菌病病原菌進行了快速鑒定；(3)遺傳作圖，Welsh等[2]成功地應用AP-PCR方法快速鑒定了重組鼠(C56BL/6J×DBA/2J)擴增多態性在染色體圖譜中位置。

1.2 LP-PCR和彩色PCR

1.2.1 LP-PCR和彩色PCR的定義

LP-PCR(Labelled primers PCR)，即標記PCR，它是指利用同位素、熒光素等對PCR引物5’端進行標記，通過PCR反應擴增，來檢測目的基因存在與否。

彩色PCR (Color Complement Assay)是指利用熒光染料標記引物的 5’端，不同熒光(熒光染料TAMRA呈紅色熒光，JOE和 FAM呈綠色熒光，COUM 呈藍色熒光)標記的引物同時參加反應，經PCR反應擴增后，根據不同熒光的色澤來判斷目標基因是否存在及擴增基因的類型[4]。

1.2.2 LP-PCR和彩色PCR的比較

LP-PCR與彩色PCR由熒光PCR[5]發展而來，彩色PCR是LP-PCR的一種。與常規PCR相比，LP-PCR更為直觀，其省去了限制性內切酶酶解及分子雜交等繁瑣步驟，并且一次可以同時分析多種基因成分，但是LP-PCR只能對產物進行定性鑒定。與LP-PCR相比，彩色PCR通常需要2種不同顏色的引物：一種作為基因檢測引物；另一種作為控制條件的內對照，但是在檢測多點突變時，彩色PCR需用更多的色彩[4]。

1.2.3 LP-PCR和彩色PCR的應用

LP-PCR和彩色PCR是常規PCR技術與標記技術相結合的產物，LP-PCR常被用于大量臨床標本的基因診斷，同時可用于對 PCR產物進行定性鑒定。彩色PCR常被用于檢測基因的突變，染色體重排或轉位，基因缺失及微生物的型別鑒定等，如被用于檢測多突變點的遺傳病[4]。

1.3 免疫PCR技術

1.3.1 免疫PCR技術的定義、來源及特點

免疫PCR(immuno polymerase chain reaction, IMPCR)是利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術，它綜合了固相免疫反應和PCR的特點。免疫PCR技術是1992年Sano建立的一種檢測微量抗原的高靈敏度技術[6]。與常規PCR及普通ELISA相比，免疫PCR優勢明顯，具體表現為：靈敏度增加，可以同時進行多種抗原/半抗原檢測，有更寬的線性范圍[7]。

1.3.2 免疫PCR技術的應用

免疫PCR技術是常規PCR技術在醫學免疫學領域的主要擴展，它常被用于：(1)激素和細胞因子的檢測，Furuya等[8]運用免疫PCR技術對白介素-18進行了檢測，靈敏度提高了10000倍；(2)生化酶類的檢測，Chang等[9]通過改良的免疫PCR方法對大腸桿菌β-葡萄糖苷酶進行了檢測；(3)致病微生物的檢測，Monteiro等[10]將磁珠技術和免疫PCR技術相結合，設計了一種能檢測糞便中幽門螺桿菌的新方法；(4)寄生蟲感染的檢測，國內利用免疫PCR技術檢測弓形蟲C抗原，敏感性較ELISA法提高了200倍[2]；(5)其他毒素或蛋白的檢測，宋云揚等[11]建立的檢測金葡菌腸毒素B的雙抗體夾心免疫PCR方法比ELISA靈敏度高1000倍。

1.4 原位PCR技術與原位反轉錄PCR技術

1.4.1 原位PCR技術與原位反轉錄PCR技術的定義

原位PCR(in situ polymerase chain reaction)技術將PCR高效擴增與原位雜交的細胞定位相結合，在組織細胞水平，原位檢測單拷貝的特定 DNA或 RNA序列[12]。原位反轉錄 PCR技術(in situ reverse transcription PCR,RT in situ PCR or in situ cDNA PCR)，簡稱原位 RT-PCR，它是指先將細胞和組織進行處理(固定、酶消化)，以獲得適度的細胞通透性；再通過逆轉錄使rnRNA轉錄成cDNA；然后把載玻片放人熱循環機，對靶DNA等細胞內靶目標在原位進行 PCR擴增(擴增反應中含有標記的單核苷酸)；最后通過檢測標記產物的方法檢測擴增產物[13]。

1.4.2 原位PCR技術與原位反轉錄PCR技術的比較

原位 PCR技術在進一步提高以單細胞底物進行PGD (preim plantation genetic diagnosis,PGD)的效率的前提下，由 Thornhill［14］提出，它具有細胞定位能力和高度特異敏感。原位反轉錄PCR技術是原位PCR技術的一種，它檢測的靶序列為RNA，由Nuovo等[15]1992年發明，具有操作簡單、流程短、省時等優點；同時具有特異性差、容易出現非特異性 DNA產物、造成假陽性、且擴增效率較低，特別是石蠟切片[16]等缺點。

1.4.3 原位PCR技術與原位反轉錄PCR技術的應用

原位PCR技術是常規PCR在細胞學領域的擴展，它常被用于感染性外源基因的檢測、內源基因的檢測與導入基因的檢測等，如對H IV、結核桿菌等進行的檢測[17]。原位反轉錄PCR技術常被用于擴增和檢測標本中罕見的rnRNA，如定量細胞表達特殊rnRNA的豐度、檢測擴增產物的細胞起源及檢測細胞群中基因表達的趨勢等[18]。

1.5 定量PCR技術

1.5.1 定量PCR技術的定義及特點

定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技術有廣義和狹義兩層含義。廣義的定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監測，進行PCR起始模板量的定量。狹義的定量 PCR技術，又稱為實時熒光定量 PCR技術(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)，它是嚴格意義上的定量 PCR技術，指用外標法(熒光雜交探針保證特異性)通過監測PCR過程(監測擴增效率)達到精確定量起始模板數的目的，同時以內對照有效排除假陰性結果(擴增效率為零)，1996年由美國Applied Biosystems公司推出。與常規PCR技術相比，定量PCR技術不僅實現了對DNA模板的定量，同時具有靈敏度更高、特異性和可靠性更強、能實現多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點[19]。

1.5.2 定量PCR技術的應用

定量PCR技術實現了PCR技術從定性分析到定量測定的發展，它常被應用于臨床微生物、食品微生物、臨床腫瘤學的檢測、腫瘤耐藥基因表達的研究、細胞因子的表達分析等方面。其中，臨床微生物和食品微生物是定量 PCR應用中最重要的兩個方面，彭年才等[19]2010年自主研發了用于食品安全檢測的實時定量PCR儀，并已投入產業化應用。

1.6 多重PCR技術

1.6.1 多重PCR技術的定義及特點

多重PCR(multiplex PCR)是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，它最明顯的優點是省時、省力、能夠快速檢測和鑒別病原體[20]，另外，多重PCR還可以精確地估計一個樣品中模板數量。

1.6.2 多重PCR技術的應用

多重PCR技術將多個PCR反應放在同一個體系內，進一步提高了PCR反應的效率，它被廣泛地用于病原體鑒別、性別鑒定、連鎖分析、法醫研究、模板檢測和基因的疾病診斷等方面，高玉龍等[21]對煙草轉基因進行了檢測。

1.7 反向PCR技術

1.7.1 反向PCR技術的定義及特點

反向 PCR(reverse PCR)，又稱為染色體緩移(chrornosome walking)[22]，它是指利用在已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對此段DNA進行酶切，在DNA連接酶作用下自連形成環狀DNA分子，然后利用方向合適并與已知序列兩端互補的引物，以連接成環的DNA為模板，經PCR擴增，得到已知序列的旁側DNA片段。與常規PCR技術相比，反向PCR優勢突出，但它需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切，另外，由于大多數有核基因組含有大量中度和高度重復序列，在YAC或Cosmid的未知功能序列中有時也會存在這些序列，從而導致反向PCR得到的探針與多個基因序列雜交，影響擴增效果。

1.7.2 反向PCR技術的應用

反向PCR技術在檢測病毒、轉座子等在基因組中的整合位點，建立基因組步移文庫及研究基因的上游調控元件等方面較常規PCR技術優勢明顯[22]，Souer等1995年將反向PCR技術與差別篩選法相結合，從矮牽牛W138中分離得到了高效轉座子標簽dTph1標記的基因。

1.8 錨定PCR技術

1.8.1 錨定PCR技術的定義及特點

錨定PCR(Anchored PCR)[23]，又稱固定PCR，它以基因組總 DNA為模板，用一條基因特異性引物進行線性PCR擴增，產生單鏈擴增產物；在末端轉移酶的作用下，在單鏈DNA分子的3’末端加上多聚胞嘧啶；用巢式基因特異性引物與多聚胞嘧啶配對的錨定引物對加尾的產物進行PCR擴增，PCR產物連入載體后進行測序鑒定。與常規PCR技術相比，錨定PCR技術特異性高、有較長的步行距離，一次實驗可以獲得1.5 kb左右的目的片段，同時它無需對基因組總 DNA進行限制性內切酶消化及連接反應，另外，其操作過程較其他方法簡單，大約2-3個工作日就能完成。

1.8.2 錨定PCR技術的應用

錨定PCR技術解決了常規PCR技術所不能完成的已知片段側翼序列的克隆問題，是常規PCR技術的又一重大擴展，賈小平等[24]用A-PCR對谷子微衛星文庫進行了篩選。

1.9 兼并引物PCR技術

1.9.1 兼并引物PCR技術的定義

兼并引物PCR(degenerate primer PCR)是指針對由密碼子的兼并性引起的，單以氨基酸順序推測編碼的 DNA序列的不精確性，設計成對兼并引物，通過PCR擴增所有編碼已知順序的核酸序列。

1.9.2 兼并引物PCR技術的應用

兼并引物PCR技術是常規PCR技術在蛋白領域的應用，具體表現在兩個方面：(1)尋找新蛋白已被測定的一段氨基酸序列的相應基因；(2)尋找具有進化上保守結構域的蛋白質家族新成員的基因[25]。陶愛林等[26]采用該技術成功進行了蓰草花粉過敏原全長同源基因的克隆。

1.10 重組PCR技術及其應用

1.1 0.1 重組PCR技術的定義

重組PCR (recombinant PCR)是通過DNA重疊序列的銜接作用，使多個 DNA分子融合在一起的體外擴增技術[27]。它包括三個階段：(1)制備用于重組的DNA組件；(2)組件分子作為引物互為模板延伸；(3)克隆和定向篩選重組產物[28]。

1.1 0.2 重組PCR技術的應用

重組PCR技術的出現，使常規PCR技術得到進一步擴展，它是PCR技術在核酸與蛋白兩個領域應用的結晶。重組PCR技術的應用主要表現在：(1)精確解析大分子功能和相互作用的結構基礎，如標定活性位點的關鍵殘基、確認已知蛋白中未知功能的結構域、揭示配體-受體識別過程中相互臨近的區域等。(2)探索順式作用元件的調控機理，揭示mRNA的非翻譯區的功能、確定啟動子和增強子成分的功能等。(3)嵌合受體在研究信號途徑和胞內定位中具有獨特的“釣魚”優勢，用功能已知的分子和待研究對象嵌合來研究結合TGF之后的TGFR二聚化形式和內向整流型鉀通道的脂筏定位過程[29,30]，(4)開發新型載體，比如通過DNA重排來增強綠色熒光蛋白 (GFP)的熒光穩定性；(5)升級分子標記，通過DNA改組已經獲得的重組擬南芥K+轉運蛋白可以使植株內的鉀離子富集度提高26.1%；(6)重組 PCR在蛋白體外定向進化中的的應用最引人矚目；(7)基于重組PCR技術的分子育種 (molecular breeding)在疫苗研發中有著廣闊的應用前景，以HIV病毒疫苗研制為例，2002年運用DNA shufling技術突破了HIV的宿主專一性，得到了高復制率的嵌合猿-人免疫缺陷病毒(SHIV)[28]。

2 PCR技術在煙草領域的應用

2.1 煙草轉基因的檢測

煙草作為基因工程研究的模式植物，轉基因體系已經很成熟，但是由于對轉基因安全性不確定，目前我國還不允許種植轉基因煙草。在轉基因檢測方法中，對轉基因所用載體特異序列進行PCR擴增是最簡單有效的，其精確度可達0.1%[21]，而多重PCR與錨定PCR[31]的應用使得這項檢測更加簡單、有效。

2.2 常規煙草病毒病的鑒定

我國煙區有15種病毒病危害煙草，不同病毒可能造成相似的癥狀，而不同條件下相同病毒也可能造成極為不同的癥狀，由于不同種類病毒在傳播方式、流行規律和防治方法等方面差異較大，病毒種類的準確的鑒定是進行有效防治的前提。顏培強等2004年應用多重PCR原理建立了適于復合侵染病毒種類鑒定的PCR鑒定技術，采用熒光定量PCR技術建立了適于病毒定量研究的煙草病毒定量檢測技術，為煙草病毒病藥效防治效果評估和病毒在植株體內的消長規律研究提供了更為精確的檢測方法。

3 展 望

PCR作為一項“革命性的技術”，不僅推動了遺傳與分子生物學的發展，而且在其它領域科學家的努力與創新下，其不斷與該領域的核心技術相結合，極大地推動了此領域的發展。另外，PCR技術從問世便成為生物學界的一大熱點，它在煙草領域的應用由來已久，它的出現對煙草領域的研究者們造成了極顯著的影響，同時也極大地促進了煙草領域的研究。總之，隨著科學技術的不斷進步，PCR技術必將得到新的發展，以之為基礎的新技術將不斷出現，它在煙草領域研究中的作用亦日漸明顯。

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