藥用植物細胞懸浮培養的影響因素

董燕,刁玲武,周聯

(廣州中醫藥大學免疫與分子生物學研究室,廣東 廣州 510405)

近年來,隨著中藥現代化的發展,對藥用植物的用量及質量要求不斷提升。我國雖有豐富的野生中藥資源,卻因生態環境的不斷破壞、無計劃的采伐等因素,有限的野生藥用植物資源日益減縮。通過大田栽培藥用植物是目前滿足中藥市場的一種有效手段,但這必然占用大量可耕種土地,引起藥用植物栽培與農作物種植爭地的矛盾。同時,如人參等一些藥用植物的栽培會導致大量山林被砍,造成水土流失、生態環境的破壞及生物多樣性的流失等問題。

生物技術的不斷發展,為藥用植物的研究和發展提供了良機和手段。將植物細胞懸浮培養技術應用于藥用植物,可在完全人工控制的條件下獲得藥用植物細胞及其次生代謝產物,從而有效解決野生資源不足及占用大量土地的問題。

1 植物細胞懸浮培養

植物細胞懸浮培養是指植物細胞或小的細胞聚集體在不斷攪動或搖動的液體培養基中進行懸浮培養。其特點是在完全人工控制的條件下進行,不受地區、季節、土壤及有害生物的影響,且生產周期較短,可通過選擇優良培養體系和改變培養條件獲得超過傳統植物栽培所得的代謝產物。

1954年,M uir等第一次進行了植物細胞懸浮培養,自上世紀六十年代,開始應用于藥用植物次生代謝物的生產,至八九十年代,可批量獲得藥用植物細胞的次生代謝產物,如抗癌藥物紫杉醇及抗菌藥小檗堿等[1]。

目前,用于細胞培養的藥用植物已有 200多種,可產生 500多種有效成分,如培養人參細胞生產保健藥物人參皂苷、紫草細胞生產療傷藥物紫草寧、黃連細胞生產抗菌藥物小檗堿、長春花細胞生產阿嗎堿、紫松果

基金項目:國家自然科學基金資助項目(30772737);廣東省自然科學基金項目(5004272)

作者簡介:董燕 (1969-),女,副研究員,博士,主要從事分子生物學技術在中醫藥研究中的應用方向的科研與教學工作。

收稿日期:2010-12-15

修回日期:2011-01-04

菊細胞生產免疫活性多糖、紅豆杉細胞生產抗腫瘤藥物紫杉醇等。從植物細胞培養中得到的藥用成分還有喜樹堿、莨菪堿、小檗堿、奎寧、地高辛、天仙子胺、山萆、芥皂疳元等。目前,中國科學院植物研究所的紫草培養、華中理工大學的紅豆杉培養和中國藥科大學的人參培養

[2]

等均已實現規?；a。另外,近年來利用植物懸浮培養細胞或不定根、發狀根對外源化學成分進行生物轉化的研究也在悄然興起,并取得了一定的進展。

隨著藥用植物細胞懸浮培養技術的不斷發展,為中藥資源的可持續發展開辟了一條新途徑。但建立良好的藥用植物細胞懸浮培養體系,相關影響因素非常多,確定各因素的最佳條件是獲得良好藥用植物細胞懸浮培養體系的關鍵。

2 愈傷組織對細胞懸浮培養的影響

進行懸浮培養的細胞大多來自愈傷組織,所以能否成功建立一個穩定的細胞懸浮系,首先取決于培養材料 -愈傷組織的狀態。愈傷組織繼代培養過程中,常常出現多種類型的愈傷組織,根據能否發生體細胞胚胎而將愈傷組織分為胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織兩種類型。只有胚性愈傷組織才有可能成功地建立胚性細胞懸浮系。而外植體的來源和狀態決定著其所誘導的愈傷組織的活力狀態,進而影響細胞懸浮培養系的質量和單細胞的再生能力。

2.1 外植體的選擇

選擇適宜的外植體才能獲得良好的培養材料,最終才能成功建立一個分散性好、穩定的細胞懸浮體系。一般用于誘導愈傷組織的外植體以幼嫩的組織或器官及種子萌發的無菌苗為好。不同植物可選擇的外植體差異較大,木本及花卉則往往以葉片、莖尖、芽尖、花藥等為外植體,但也不是絕對的,木本植物杜仲在一定的培養條件下也可通過子葉和胚軸來誘導愈傷組織[3]。草本植物及禾本科的幼穗、胚、成熟種子、花藥、胚軸、胚根、芽尖等均可作為外植體誘導愈傷。例如,草本藥用植物脹果甘草細胞的懸浮培養研究中發現,子葉來源的愈傷組織在液體培養基中生長最好,根來源的細胞在培養液中會迅速褐化而死,而下胚軸來源的愈傷組織的培養周期比葉來源的長[4];草坪草一般以幼穗為外植體往往可獲得較成熟種子更高的愈傷誘導率,但材料受季節限制不易獲得,通常用成熟種子誘導愈傷組織。石斛等蘭科植物則直接采用原球莖細胞進行懸浮培養。選擇合適的外植體才能獲得生長快、疏松型的愈傷組織,為進行細胞懸浮培養生產打好基礎。

2.2 愈傷組織狀態

懸浮細胞系的建立通常是以生長快、易散碎的松散型胚性愈傷組織為起始材料。而實驗所得愈傷組織通常有 3種類型:I型為質地堅硬、塊狀、顏色鮮黃的胚性愈傷組織;Ⅱ型為質地疏松、易分散、不分泌黏液的顆粒狀胚性愈傷組織;Ⅲ型為柔軟、水漬、形狀不規則、顏色淡白的非胚性愈傷組織。I型雖有胚性但質硬,不容易分散;Ⅲ型活力不佳,不具胚性;為達到細胞懸浮培養分散性好的要求,結構松脆、分裂能力強、增殖速度快,并且具有胚胎發生能力的Ⅱ型愈傷組織作為藥用植物細胞培養的材料是最佳的選擇[5-6]。

3 培養基對細胞懸浮培養的影響

不同培養基中各成分的種類和濃度有異,對不同植物細胞生長的影響迥然不同,所以選擇合適的培養基也是成功建立藥用植物細胞懸浮培養體系的重要因素之一。

3.1 基本培養基的選擇

基本培養基主要是無機鹽,而不同科屬的植物對營養物質的需求不盡相同,所以在植物細胞懸浮培養時,對無機鹽的種類及濃度要求也有所不同。植物主要常用的基本培養基有 W hite、Heller、M S、ER、B5及N 6等幾種。培養基中大量元素的濃度對懸浮培養愈傷組織細胞存活率有較大影響,如培養基中大量元素總濃度過高時,枸杞懸浮系中除活細胞百分率降低外,還可看到許多細胞呈皺縮狀態,這說明培養液滲透壓過高[7]。目前研究表明,M S培養基有利于大部分藥用植物細胞的懸浮生長,如杜仲、紅景天、益母草、半夏、黃芩、紅豆杉及白木香等[3,8-13]。但對目的在于生產次生代謝產物的細胞培養,選擇培養基還需考慮到次生代謝產物的產量,在促進丹參懸浮培養細胞生長和水溶性酚酸含量的因素研究中就發現,M S培養基雖有利于丹參懸浮細胞的生長,但是 6,7-V培養基更利于丹參酚酸的合成積累,因此綜合考慮選擇 6,7-V培養基作為丹參懸浮細胞培養基最佳[14]。但也有研究認為,改良的 B5培養基利于愈傷組織的誘導及后繼的培養,在建立印楝懸浮細胞系時,發現 B5培養基優于M S培養基,將愈傷組織接種在 B5培養基中易得到比較均勻的懸浮培養系,且細胞生長迅速,但在M S培養基中的愈傷組織懸浮起來比較困難,生長緩慢并出現了褐化現象[15]。

3.2 激素種類和濃度

激素是調節植物細胞生長發育和代謝產物形成的主要物質,植物激素的種類和濃度的差異對不同種類的植物細胞生長有不一樣的影響。

首先,激素在獲得培養材料 -愈傷組織時就充當著極其重要的因素,通常當生長素與細胞分裂素濃度比例高時,易誘導根;當比例適當時,只誘導愈傷組織,而不產生根和芽;當二者的比例小時,誘導芽的產生[16]。然而,不同藥用植物所需要的激素種類及激素的絕對量不盡相同,需根據不同種類藥用植物的需求進行添加。一般認為以 2,4-D組合其它種類的激素是誘導愈傷組織的最佳選擇,對南方紅豆杉及輪葉黨參愈傷組織的誘導結果就表明,2,4-D比萘乙酸(NAA)更有利于愈傷組織的形成[17-18]。

其次,在藥用植物細胞培養時,激素是影響細胞狀態及次生代謝物形成的重要調控因素。激素種類選擇不當、濃度過低或過高,會對植物細胞的生長和代謝產物的形成產生抑制作用。雷公藤愈傷組織懸浮培養中,在含 2,4-D的培養液中生長最慢,干培養物產量最低,在含 IAA的培養液中,細胞生長速度和干物質產量中等,在含 NAA的培養液中生長最快,每升培養液收獲的干培養物產量最大[19]。在銀柴胡的懸浮細胞培養研究中發現,細胞在濃度為 0.5m g/L 6-BA及0.5m g/L 2,4-D的液體培養基中比在濃度為 1～2m g/L 6-BA及 1～2m g/L 2,4-D的培養基中的生長量大[20]。而對何首烏的相關研究發現,在 M S培養基中添加適量濃度的 NAA和 BA對何首烏毛狀根的生長和蒽醌類化合物的合成有促進作用[21]。所以,為了得到良好的懸浮細胞體系添加適當配比的植物激素非常重要。

3.3 有機附加物

有機附加物對誘導疏松易碎的愈傷組織及其懸浮培養也十分重要,同時有機附加物還會影響藥用植物細胞次生代謝產物的生成。在細胞懸浮培養中常添加的有機物有氨基酸、肌醇及蔗糖等。氨基酸是常用的有機氮源之一,常用的氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰氨、半胱氨酸等。許多天然有機物或其制成品也可加入植物培養基中,如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母汁和麥芽汁等,而且比加入某種單一的氨基酸更好[22]。水解酪蛋白能顯著提高南方紅豆衫懸浮細胞的生長速率和細胞培養的密度[23]。肌醇對懸浮細胞的生長也有一定的影響。但有人認為,不同濃度的肌醇對半夏懸浮細胞生長影響不大,濃度過高可抑制細胞的生長[24]。也有研究證實,肌醇能促進龍眼胚性懸浮細胞系的分化,延緩懸浮細胞系的衰老[25]。糖類物質是植物組織和細胞培養中最常用的碳源和能源,同時又是維持細胞生長所需滲透壓的滲透壓穩定劑。培養基中的蔗糖濃度由 2%增加到 3%時,黃連懸浮細胞生長有明顯增長,但在 3%～6%的蔗糖濃度范圍內,收獲物的干重、細胞生長速率未有明顯變化;當蔗糖濃度為 7%時,生長速率開始下降,說明 3%的蔗糖濃度適合黃連細胞生長,未加蔗糖的對照則呈負數增長,這與細胞生長受到抑制和部分細胞褐變死亡有關[26]。

4 培養條件對藥用植物細胞培養的影響

除培養材料及培養基之外,細胞懸浮培養還受其它培養條件的影響,如細胞培養的起始密度、pH值、光照、繼代周期與轉速等。

4.1 起始密度

藥用植物細胞懸浮培養時,細胞起始密度對懸浮細胞生長影響較大。因為植物細胞間的聯系通常比微生物細胞的聯系密切得多,細胞要維持分裂和生長,其內源代謝物質必須達到一定的閥值,在有高密度細胞群和培養基營養豐富的情況下,易于達到這種閥值。而在低密度下,由于細胞少,其向外滲透的代謝物總量少,很難提高培養基中的代謝物濃度,因而也就很難使細胞本身存留的代謝物達到標準的內源水平,使細胞難以分裂。因此植物細胞懸浮培養時必須達到最低有效密度。在白木香懸浮細胞培養體系的建立中就說明,初始接種量過低會使細胞活力低,生長緩慢,而接種量超過一定量時細胞生長量也會降低,懸浮液會逐漸渾濁[16]。因此,在建立藥用植物細胞懸浮培養體系時,需根據不同植物細胞生長特性確定最佳初始接種量。

4.2 pH值

pH值對植物細胞會產生諸多影響,包括引起質膜通透性變化,影響物質的吸收以及植物細胞的代謝等。有研究表明,在 pH值為 5.3和 5.8時,細胞的生長量基本相同,說明細胞具有一定的自身調節能力,在一定范圍內細胞釋放的物質可以調節培養基 pH至細胞生長的適宜值[16]。然而細胞培養液 pH值隨培養時間延長有明顯的變化,可能超出了細胞自身調節的范圍。在西洋參、半夏及蘆薈等藥用植物懸浮細胞培養過程中,培養液的 pH值會逐漸降低,通過對其動態變化過程研究,可以人工添加適量酸堿值穩定劑,使培養液pH值始終維持在有利于細胞生長的范圍內,從而獲得更大生長量。一般藥用植物細胞生長最適 pH值為5.8～6.0[27]。

4.3 光照

植物細胞內活性物質的生物合成受到多種內外因子的影響,其中光強和光質是環境中重要的影響因素[28]。一般植物細胞培養所采用的光照條件為1 500～2 000 lx,光照時間 14h/d。有學者通過研究光質對黃芩細胞懸浮培養的影響證實,不同光質對黃芩懸浮細胞生長、PAL(苯丙氨酸氨基裂解酶)活性和黃芩細胞中最主要的黃酮類活性物質 -黃芩苷積累有很大影響[29]。白光、紅光和藍光對懸浮培養黃芩細胞生長具有誘導促進作用,其中紅光作用最為明顯,但抑制了黃芩細胞 PAL活性和黃芩苷的積累;白光、紫外光和藍光對黃芩細胞 PAL活性和黃芩苷的積累均有增強作用。也有研究發現,紅豆杉懸浮培養細胞在暗培養時的生長量是白光培養下的 2～3倍,紫杉醇的產量也是白光培養下的 3倍。因此,在藥用植物細胞懸浮培養時進行適當的光照可促進藥用植物細胞次生代謝產物的產生。

4.4 繼代周期與轉速

繼代周期的長短和搖床轉速對懸浮細胞的生長狀態也有較大影響。短的繼代周期使細胞生長速度減慢。而繼代周期過長,細胞內含物少、液泡變大,懸浮細胞處于極度“饑餓”狀態。懸浮培養細胞的生長曲線能為細胞繼代周期的確定提供重要的參考數據:有關半夏細胞懸浮培養的研究中,以細胞鮮重為生長指標,可以看到生長曲線呈“S”型,并明顯分為延遲期、指數期和靜止期。延遲期 0～6天,細胞增長緩慢,指數期 6～18天,細胞增長迅速,18～24天為靜止期,細胞鮮重增加幾乎停止。從其細胞生長曲線可得出半夏細胞培養的繼代周期約為 24天[30]。藥用植物細胞培養的適宜轉速的確定也非常重要,若搖床速度過高易造成對細胞傷害的剪切力;若轉速過低,不但細胞易成團,且細胞堆積,造成營養“死”角,細胞得不到充足的營養,易衰老死亡,且轉速低使瓶內溶氧量減少,不利于細胞生長[31-32]。一般轉速控制在 90～120 r/m in。

5 藥用植物細胞懸浮培養存在的問題

目前,在藥用植物細胞懸浮培養方面主要存在兩方面的問題,一是細胞產生褐變,這也是植物細胞培養普遍存在的問題。第二個是如何突破藥用植物細胞的次生代謝產物不高的瓶頸問題。藥用植物進行細胞懸浮培養,它可直接用于原生質體分離、培養、雜交、基因轉移、生產次生代謝物等,還可在短期內在細胞水平篩選出預期突變體。但目前,藥用植物細胞懸浮培養主要目的在于生產次生代謝物以供藥用。

5.1 培養材料的褐變

褐變是指外植體在培養過程中,自身組織向表面培養基釋放褐色物質,以致培養基逐漸變成褐色,外植體也隨之進一步變褐而死亡的現象。在植物懸浮細胞培養過程中褐變普遍存在,一般認為木本植物更為嚴重,其是否能得到有效的控制是藥用植物懸浮細胞培養能否成功的關鍵。褐變現象的影響因素較多,如基因型、外植體、植物生長調節劑、基本培養基和培養條件等。研究表明,應用基礎培養基 M S、B5和 6,7-V能有效減少藥用植物細胞懸浮培養中發生褐變現象[33]。細胞培養中所用激素對不同愈傷組織和細胞的作用是不一樣的,對褐變的影響也不相同。在紅豆杉細胞培養中,生長素類中有關 2,4-D和 NAA這兩種激素對褐變的影響研究較多。一種結果認為,2,4-D優于 NAA,另一種結果則認為 NAA優于 2,4-D,但鑒于 2,4-D本身的致癌活性,紅豆杉要作為藥源,1.0m g/L NAA+0.5m g/L 6-BA是替代 2,4-D的適宜組合[34]。

5.2 次生代謝產物的提高

一般促進次生代謝物生成的方法有以下幾種:添加誘導子,前體飼喂,兩相培養,培養條件調控。誘導子是一種能引起植物過敏反應的物質,由于它在與植物的相互作用中,能快速、高度專一和選擇性的誘導植物特定基因的表達,進而活化特定次生代謝途徑,積累特定的目的次生代謝物,所以可以利用它來提高植物次生代謝產物的產量。目前應用最廣、研究最多的是真菌誘導子,例如戴均貴等[35]報道從 10種真菌誘導子中篩選出效果較好的日本根霉誘導子,當以濃度為5m g/L添加到銀杏(Ginkgo biloba L)懸浮細胞培養體系中,誘導培養 3天時,懸浮細胞的銀杏內酯 B(GKB)產量比對照增加約 1倍。前體飼喂是在植物細胞培養中加入次生代謝物生物合成的前體,這種方法在許多培養細胞中都取得了很好的效果。有學者在脹果甘草細胞懸浮體系中加入苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸鈉四種前體,結果顯示四種前體在合適的濃度下對細胞的生長沒有明顯的抑制作用,而且均能促進細胞內甘草黃酮的生物合成[36]。兩相培養,是指在植物細胞培養中加入水溶性或脂溶性的有機物,或者是具有吸附作用的多聚化合物,使培養體系由于分配系數的不同而形成上下兩相,細胞在其中一相中生長并合成次生代謝物,而這些產物又通過主動或被動運輸方式釋放到細胞外,并被另一相所吸附。該法可減輕產物本身對細胞代謝的抑制作用,并可保護產物免受培養基中催化酶或酸對產物的影響。調控培養條件也是提高藥用植物次生代謝產物的有效辦法,如根據不同種類的植物選擇合適的光照、培養溫度等。

6 結語

藥用植物細胞懸浮培養體系建立的影響因素有很多,雖然目前已有大量相關研究,但仍存在問題需要解決。首先,藥用植物作為一種具特殊用途的植物,除借鑒常規植物的培養方法外還需結合用藥的方法理論進行考慮,在獲得良好的細胞培養體系的同時促進其有效成分的生成,抑制非有效物質的產生,以達到有效藥用資源的最大化。其次,就是藥用植物細胞培養規模化所面臨的問題,要進一步獲得大量的藥用植物有效成分就必須進行大規模培養,但目前能進行量化生產的藥用植物只有少數幾種,原因之一就是細胞增殖率不高,產物不穩定,可考慮通過生物技術改造植物細胞的遺傳物質以提高藥用植物細胞增殖率及其次生代謝物。同時進一步探索各因素對藥用植物細胞培養的影響,根據具體藥用植物細胞的生長特點調節培養條件,以達到操作簡便、懸浮系優良的目標,為最終獲得可代替傳統藥用植物的優質中藥資源奠定基礎。

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