針灸誘導HSP70抗細胞損傷及其應用現狀的研究*

楊 舟 常小榮 劉 密 彭 亮 文 瓊

湖南中醫藥大學（湖南長沙410007）

熱休克蛋白（HSPs）廣泛存在于所有原核和真核細胞內，在機體受到如高溫、缺血或缺氧刺激后，引起生物細胞損傷，發生熱休克反應 （HSR）時所產生的細胞蛋白。一般分為HSP90、HSP70、HSP60和小分子HSP等4個家族。其中HSP70是目前備受關注、探討最多、研究最深入的一族，是HSPs家族中最重要的一族。針灸作為中醫學傳統防治疾病的方法，其本身對人體是一個應激原的刺激。近年來研究表明，針灸在治療腦缺血、心肌缺血再灌注、脊髓損傷、胃腸黏膜損傷、關節炎等方面具有誘導HSPs產生的作用［1-10］。現就近年來運用針灸誘導HSP70抗細胞損傷及其應用的研究現狀作一綜述。

1 HSP70保護細胞的機制

HSP70的細胞保護作用是指機體細胞在受到各種應激時，產生的HSP70可以增強細胞對損害的耐受程度，維持細胞的正常功能代謝，提高細胞生存率［11］。其機制主要包括分子伴侶作用、抗細胞凋亡作用、抗氧化作用、參與細胞耐熱作用。

1.1 分子伴侶作用分子伴侶是一類輔助新合成或解折疊蛋白質正確折疊和組裝的蛋白質，HSP70以ATP依賴的方式結合未折疊多肽的疏水區以穩定其未折疊的狀態，再通過有控制的釋放幫助其折疊功能，細胞內有很多蛋白質合成后暫時與HSP結合，保持其伸展狀態以利其穿過內質網或線粒體膜［12］。HSP70作為HSPs家族中主要的分子伴侶蛋白，廣泛參與機體內各細胞的蛋白質折疊和裝配過程，維持細胞蛋白穩定性，提高細胞耐受性，使細胞保持正常的生理功能。機體在受到應激原的刺激時，HSP70在染色體與核質內聚集，并以特殊的方式與解聚染色質相互作用，防止染色質和hnRNA復合物降解。HSR誘導產生的HSP70不僅能增加細胞的耐熱性，而且能增加細胞對其他應激原的耐受性，加速正常蛋白質的合成，以補充由于熱休克發生變性而減少的蛋白質，這對維持蛋白質內環境的穩定具有重要意義。

1.2 抗細胞凋亡作用細胞凋亡與機體組織自穩機制有關。目前認為HSP抗細胞凋亡作用是通過以下3條途徑實現的［13］：（1）對線粒體通路介導細胞凋亡的調控作用。易受鄉等［14］從細胞凋亡線粒體信號轉導通路入手，對艾灸促進胃黏膜HSP70表達上調對急性胃黏膜損傷細胞凋亡線粒體信號轉導途徑的相關作用靶點及其有關物質進行了研究，發現艾灸預處理足三里、梁門可以促進模型大鼠胃黏膜HSP70大量表達，抑制細胞凋亡線粒體信號途徑相關因子表達和細胞凋亡，并認為艾灸可能是通過增強胃黏膜HSP70表達，干預了細胞凋亡線粒體信號轉導途徑不同靶點，達到抑制胃黏膜細胞凋亡、保護胃黏膜損傷的作用。Iosser D等［15］也曾報道過HSP70可以通過抑制Cyt-C釋放和Caspase-9前體激活從而控制細胞凋亡。（2）對死亡受體通路介導細胞凋亡的調控作用。在死亡受體家族中最典型的是Fas和TNFRs［16］。 現在大量研究證實，HSP 能調節 Fas、TNFR 和 TNF 相關的凋亡誘導配體介導的細胞凋亡途徑。馬曉莧等［17］研究認為，針刺可下調Fas蛋白表達。還有研究發現，HSP70還會干擾在細胞毒性作用中起關鍵作用的磷脂酶A2產生活性信號轉運系統從而保護特定腫瘤細胞免受TNF介導的細胞毒性作用的殺傷［18］。（3）對細胞內抗凋亡及促凋亡信號轉導通路介導細胞凋亡的調控作用。陳蘭英等［19］研究發現，胃癌細胞在體外培養狀態下，經不同濃度HSP70單克隆抗體處理后，HSP70表達被阻斷，胃癌細胞的生長受到抑制并且發生凋亡。趙楨等［20］的研究也證實了這一點?？赡苁羌毎麅鹊腍SP70與HSP70MAb結合，失去了抗凋亡的作用；另一方面，HSP70的細胞內合成被封閉，抑制了癌細胞HSP70的作用，從而誘導胃腺癌MGC-803細胞的凋亡。

1.3 抗氧化作用缺血期間，細胞內環境發生變化，自由基產生，蛋白質特別是SOD等抗氧化酶功能喪失［21］。心、腦缺血再灌注中HSP70對心肌細胞和神經元細胞的保護功能，也是對HSP70抗氧化作用的有力證據。

1.4 參與細胞耐熱HSP70廣泛存在于細胞骨架和核骨架內，與核仁和細胞膜結合提高細胞對熱的耐受力，因此在各種細胞器中核仁和細胞膜對熱刺激尤為敏感。研究發現通過熱應激產生的HSP70也伴隨著對其它應激耐受力的提升，反之其它應激也能刺激HSP70生成和增多，從而產生熱耐受。張紅艷等［22］觀察嚴重燒傷大鼠胃黏膜HSP60和HSP70的表達變化及熱休克預處理對嚴重燒傷大鼠胃黏膜的影響，結果表明熱休克預處理誘導HSP60、HSP70過量表達后可減輕大鼠燒傷后急性胃黏膜損害。韓利芳等［23］通過對比熱應激預處理組與非預處理組大鼠腦缺血10min再灌注后12h時腦組織內HSP70和緊密連接蛋白Occludin的表達及血腦屏障通透性改變，發現熱應激預處理組動物缺血再灌注后，腦組織內HSP70及緊密連接蛋白Occludin的表達比非預處理組高，而血腦屏障通透性降低。Lee等［24］研究發現，HSP70的過量表達可以調節和抑制間質金屬蛋白酶來減少細胞、組織在缺氧情況下的損傷。Duncan等［25］的研究結果表明包括HSP90和HSP70的多種蛋白分子伴侶的復合物是熱應激蛋白合成的終止，又能促使一般的翻譯修復，從而形成熱耐受；削弱任何一個分子伴侶的作用就足以調節熱應激。

2 針灸與HSP70

大量研究表明，針灸對全身各器官組織都有不同程度的保護作用，并可誘導HSP70的產生。研究目前主要集中在腦、心、胃等主要臟器。

2.1 針灸抗腦細胞損傷與HSP70王偉等［26］采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型（MCAO），隨機分組，觀察大鼠缺血側大腦皮層HSP70蛋白表達陽性細胞數，組織學損傷分級及神經功能缺陷評分的變化。結果示腦缺血再灌注電針組較對照組HSP70陽性細胞數多，組織學損傷分級低，神經功能缺陷評分低，表明電針可以提高局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦皮層HSP70蛋白的表達，針刺治療機制可能與HSP70蛋白增加有關，唐偉等［27］通過針刺預處理，誘導大鼠腦缺血耐受，針刺預處理組術前7d予針刺雙側足三里和曲池后連接電療儀，強度以肢體輕微抖動為度，每日1次，時間30min，同時用毫針向百會穴平刺約3mm，間歇5 min捻轉1次，時間30min，7d后采用四動脈阻斷法給予全腦缺血10min，觀察大鼠大腦海馬CA1區TUNEL染色陽性細胞數，大鼠腦海馬HSP70陽性細胞數及HSP70 mRNA表達，結果發現針刺可以減少海馬CA1區神經元凋亡的發生，并且顯著增強HSP70的表達，認為抑制缺血后神經元凋亡可能是針刺預處理發揮腦保護作用的一種途徑，其保護機制可能與抑制細胞凋亡及上調HSP70 mRNA、HSP70表達水平有關。樊小農等［28］通過向頸內動脈注入自體血栓的方法建立大鼠多發梗死性癡呆（MID）模型，針刺組取人中、內關、風池穴，非穴組取雙側脅下兩固定非穴點，每日1次，連續針刺2周后觀察皮層、海馬、紋狀體和丘腦區的細胞凋亡現象及HSP70mRNA和蛋白的表達，結果顯示模型組各腦區細胞凋亡程度明顯高于假手術組，針刺組各腦區細胞凋亡程度明顯低于模型組，針刺組各腦區HSP70mRNA及蛋白表達明顯高于模型組。針剌可抑制MID模型大鼠腦細胞凋亡并且誘導MID模型大鼠HSP70的表達，并且有穴位特異性。王秀云等［29］用免疫組織化學法觀察缺血區皮層腦組織HSP70蛋白的表達變化及施加井穴放血法后對其的干預作用。結果顯示急性缺血性腦損傷可快速誘導HSP70蛋白在皮層缺血區腦組織的表達增加，其表達與缺血時間呈正相關，提示腦的缺血性損傷可應激性地增強神經細胞對缺血、缺氧的耐受和適應能力，而應用井穴放血的干預治療可明顯上調缺血區皮層腦組織HSP70的表達水平，進一步增強腦組織對抗缺血性損傷的應激能力，抵抗缺血性腦損害的進一步發展，增強腦修復能力。

2.2 針灸抗心肌細胞損傷與HSP70王祥瑞等［30］在制作兔心肌缺血再灌注模型的過程中采取電針刺激云門、列缺、內關3個穴位，通過檢測心肌細胞HSP70和c-fos的表達發現，電針刺組心肌細胞HSP70和c-fos表達量較對照組明顯增加，說明電針刺能誘導心肌細胞HSP70和c-fos的表達。孫忠人等［31］采用免疫組織化學法檢測大鼠心肌組織HSP70表達發現，逆灸與缺血預處理均可增加HSP70的表達，減輕心肌缺血再灌注對心肌造成的損傷。ZHAO等［32］利用大鼠心肌缺血再灌注模型研究大鼠細胞凋亡及HSP70mRNA表達的情況。結果發現艾灸預處理組細胞凋亡降低，HSP70mRNA表達增加，且與艾灸預處理的次數有相關性。艾灸預處理每日1次與缺血預處理預防心肌缺血再灌注損傷的效應無顯著性差異，艾灸預處理每日2次組優于缺血預處理組。表明艾灸預處理對心肌細胞缺血再灌注具有保護作用，其效應與每日艾灸次數有關。

2.3 針灸抗胃黏膜損傷與HSP70常小榮等［33］艾灸大鼠足三里、梁門等穴位，預處理7d后采用水浸-束縛應激法制備大鼠應激性潰瘍模型，發現艾灸足三里等穴可使大鼠胃黏膜損傷指數（UI）明顯下降，經艾灸預處理的大鼠胃黏膜PGE2含量均有不同程度升高，ET含量下降顯著，HSP70蛋白和mRNA表達顯著增強，說明艾灸足三里、梁門能通過增強HSP70的蛋白和基因表達，達到胃黏膜保護作用，并有一定的穴位特異性。杜燕等［34］采用無水乙醇灌胃制備急性胃黏膜損傷模型，通過艾灸足三里、中脘后，按Guth法計算UI，HE染色觀察胃黏膜組織形態學變化，免疫組織化學法檢測胃黏膜細胞中HSP70的表達，放免法測定血清中炎性細胞因子的含量。結果與對照組比較，模型組UI、血清中炎性細胞因子含量明顯升高，胃黏膜組織炎性浸潤明顯。與模型組相比，艾灸組UI、血清中炎性細胞因子含量明顯降低，胃黏膜組織形態較為完好，HSP70大量表達。表明艾灸足三里、中脘穴對大鼠急性胃黏膜損傷具有一定的保護作用，其機制可能與誘導機體產生大量HSP70抑制炎性細胞因子的釋放有關。易受鄉等［35］通過艾灸“足三里-梁門”穴組及非穴位對照點，束縛水浸應激法制備胃潰瘍模型，結果束縛水浸應激法造模后可致胃黏膜損傷指數升高，胃黏膜TGF-α含量下降，PCNA下降，細胞凋亡指數、HSP70 mRNA增加。艾灸足三里、梁門可降低胃黏膜損傷指數，增加胃黏膜TGF-α含量，促進HSP70 mRNA和PCNA的表達，降低胃黏膜細胞凋亡指數，與模型組和對照組比較有顯著性差異。表明艾灸足三里、梁門對應激性胃潰瘍的胃黏膜具有保護作用，其機制可能是促進了TGF-α合成，刺激胃黏膜細胞增殖，抑制細胞凋亡，而這一過程可能與艾灸誘導HSP70表達有關。

3 討 論

HSP70對正常和非正常狀態下生物體的生存作用是非常復雜和重要的，具有廣泛的應用前景。針灸作為一種良性的應激原，通過針刺的機械刺激、艾灸的溫熱刺激，或借助藥物、電光等理化方法刺激相關腧穴，激發人體經絡之氣，從而達到協調陰陽、調整虛實、抵御病邪的目的，具有誘導HSP70和HSP70mRNA的大量表達作用，這種表達作用還與腧穴的特異性以及針灸刺激量效相關。針灸誘導產生HSP70是針灸發揮治療及保健作用的重要機理之一，同時針灸預處理對HSP70的影響也豐富了針灸“治未病”理論，為這一理論在臨床上的應用提供了實驗依據［36-37］。

綜上所述，針刺和艾灸通常各自應用于誘導某些特定臟器HSP70表達的研究，例如針刺主要運用在心、腦缺血再灌注，艾灸則更多地運用在修復胃黏膜損傷的方面，缺乏針刺與艾灸誘導同一臟器HSP70表達情況對照以及針灸的量效因素對HSP70量的表達影響的相關研究。而且對HSP70的研究目前還是以動物實驗為主，涉及的疾病范圍相對狹隘，臨床研究較少。因此，還應進一步擴大研究范圍，并在研究條件允許的前提下采取阻斷HSP70的研究方法，以提供更豐富、更扎實、更直接的研究證據。

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