融合蛋白AML1-ETO的生物學功能及致癌機制探討*

劉曉曉， 張 波， 趙 倩△

(1上海交通大學醫學院病理生理教研室； 2中國科學院上海生命科學研究院/上海交通大學醫學院 健康科學研究所，上海 200025)

·綜述·

融合蛋白AML1-ETO的生物學功能及致癌機制探討*

劉曉曉1,2， 張 波1， 趙 倩1△

(1上海交通大學醫學院病理生理教研室；2中國科學院上海生命科學研究院/上海交通大學醫學院 健康科學研究所，上海 200025)

AML1-ETO融合蛋白是染色體易位t(8;21)(q22;q22)的產物，見于15%的急性髓細胞性白血病(acute myelocytic leukemia, AML)，在FAB (French-American-British, FAB) 分型M2型白血病中的陽性率為40%-50%，其中M2b亞型中的陽性率為90%，少見于M0、M1和M4型白血病，極少見于骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome, MDS)。AML1-ETO融合蛋白全長含有752個氨基酸，其N端為RUNX1(runt-related transcription factor 1), 也稱為AML1、CBFα2或者PEBP2αB區，含有結合DNA的結構域；C端為8號染色體編碼的RUNX1T1 [runt-related transcription factor 1; translocated to, 1 (cyclin D-related)]，也稱為ETO(eight-twenty-one)。

AML1蛋白與ETO蛋白融合后使AML1蛋白從轉錄活化因子轉變為轉錄阻遏物，抑制AML1靶基因轉錄表達。研究還發現表達AML1-ETO的 U937細胞的確出現了分化阻滯，同時又出現了細胞凋亡敏感性增強的現象[1]。利用表達AML1-ETO轉基因小鼠的研究也發現，轉基因小鼠出現了造血系統的異常，但并未發生白血病[2]。因此基因的二次打擊事件引起了研究者的注意，研究者認為融合基因AML1-ETO的產生增加了基因組的不穩定性，基因組發生了其它的基因改變事件，促發了白血病的發生。文獻報道在許多t(8;21)陽性的病人基因中發現了有kit基因(也稱為c-kit基因)的突變以及異常的AML1-ETO截短體的存在。

1 融合蛋白AML1-ETO的生物學功能

融合蛋白AML1-ETO是染色體t(8;21)(q22;q22)的產物。AML1由染色體21q22編碼，是造血分化過程中的一個重要的轉錄因子。AML1是一種具有DNA結合序列特異性的DNA結合蛋白，屬于核心結合因子家族(core-binding factors，CBFs)，AML1即CBFα2，需要與CBFβ亞基形成異二聚體來活化靶基因的轉錄。在異二聚體中AML1亞基具有結合DNA的能力，CBFβ亞基不直接與DNA結合而是與AML1亞基結合并增強AML1與DNA結合的能力。ETO基因位于染色體8q22，ETO也稱為MTG8。融合蛋白AML1-ETO幾乎包含了ETO蛋白的全長，ETO蛋白含有4個與Nervy蛋白同源的功能域(NHR1-4)。NHR2功能域含有疏水性氨基酸7 肽重復序列，能介導ETO家族成員間的二聚化，二聚化的NHR2能與mSin3A/HDAC共抑制復合物發生作用。NHR4功能域含有2個鋅指結構，能夠募集N-CoR/SMRT/HDAC共抑制復合物[3]。

1.1融合蛋白AML1-ETO的轉錄抑制作用 融合蛋白AML1-ETO可作用于AML1的靶基因，與DNA啟動子或增強子區域的序列結合，而且保留了與CBFβ形成二聚體的能力。在正常情況下，AML1作為大部分靶基因的轉錄活化因子，作用于靶基因的啟動子區域促進基因的轉錄活化。但在發生t(8;21)染色體易位后，融合蛋白AML1-ETO丟失了AML1 C末端的活化功能域，AML1-ETO通過RUNX1的RHD結構域作用于AML1的靶基因，ETO通過它的NHR功能域招募轉錄共阻遏物，如mSin3A、SMRT以及組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)。因此AML1-ETO對于AML1的靶基因來說是一個轉錄阻遏物，抑制靶基因的轉錄活化[4]。在對AML1-ETO融合基因Knock-in 小鼠的研究中發現，AML1-ETO 是通過一種顯性負作用的方式抑制AML1-依賴 的轉錄活化。Knock-in 1個AML1-ETO等位基因的雜合子小鼠出現的表型與敲除AML1或CBFβ的小鼠出現的表形類似，它們均在胚胎期(胚胎期的13.5 d)死亡，伴隨有顱內出血和造血細胞分化的阻滯[5]。利用線蟲作為模式動物也發現，在它的胚胎造血細胞中過表達AML1-ETO，可以抑制RUNX1+血細胞系的分化，并導致了在蛹期的100%致死率[6]。

AML1基因是在發育早期表達的基因，在卵黃囊造血的后期以及胚肝造血期對造血干細胞的出現起著重要的作用，但當胚胎的后期造血完全以骨髓為主時，AML1的功能則主要側重于參與干細胞的定向分化[7]。在髓系前祖細胞中表達融合蛋白AML1-ETO 則會阻滯粒系的分化。對粒系分化的阻滯作用主要是由于AML1與ETO的融合使得AML1從轉錄活化因子轉變為轉錄阻遏物，導致與粒系分化相關的靶基因如兩個重要的轉錄因子C/EBPα、PU.1 表達下調[8，9]。最新研究發現Pirin(PIR) 在表達融合蛋白AML1-ETO的白血病細胞中表達明顯下調，而PIR是一種新發現的轉錄調節因子，它對髓系細胞的分化成熟起著重要的作用，所以PIR的表達下調可能是導致白血病細胞分化阻滯的原因之一[10]。

1.2融合蛋白AML1-ETO在造血干細胞增殖中發揮作用 在純化的造血干細胞中表達AML1-ETO 后移植到小鼠體內10個月后發現骨髓內原始粒細胞增加了約10%，與此相符合的是表達AML1-ETO的造血干細胞髓系集落形成細胞增加了50倍，同時在骨髓內可發現晚幼粒細胞的累積還伴有數目增多的不成熟的嗜酸性粒細胞，這些嗜酸性粒細胞內有不正常的嗜堿性顆粒。還發現與對照小鼠比較，移植10個月后，造血干細胞的數目增加了29倍，這暗示AML1-ETO的表達破壞了正常的基因對“造血干細胞池”大小的控制和調節[11]，在隨后的基因微陣列分析中發現，AML1-ETO可以活化許多基因的表達，許多被AML1-ETO活化的基因在干細胞的自我更新中起作用[4]。Alcalay等[12]發現AML1-ETO可誘導Jagged1的表達，Jagged1是一種Notch配體，具有促進干細胞增殖的能力，Jagged上調引發了Notch通路的活化而且在t(8;21)陽性的AML細胞表達Notch靶基因HES1。此外，AML1-ETO可以促進微小RNAmiR-24的轉錄表達，而miR-24具有促進髓系細胞增殖，抑制髓系細胞分化的作用[13]。在人類CD34+造血干祖細胞中高表達AML1-ETO 可以增強外源性的神經生長因子以及IL-3 對細胞的生長促進作用。以上發現可得出這樣的結論：在造血干祖細胞中AML1-ETO通過反常上調Jagged1以及miR-24等靶基因來促進早期多潛能造血祖細胞的增殖。

1.3融合蛋白AML1-ETO對靶位點的表觀遺傳學修飾作用 在對AML1-ETO下調的靶基因研究中發現，靶基因的AML1結合位點以及轉錄起始位點存在著異常的組蛋白去乙酰化改變，并且發現其中一個基因Mgmt的啟動子區域有CpG 島，這個CpG島存在著超甲基化現象。這些表觀遺傳學修飾導致染色體發生抑制性的改變，如結構變得更加緊密等，從而抑制相應靶基因的轉錄。這個研究表明與白血病相關的融合蛋白可以在基因組的特定位點產生獨特的表觀遺傳學的抑制作用，并且這些表觀遺傳學的改變并非是隨機的[14]。最近有研究發現微小RNAmiR-223是融合蛋白AML1-ETO作用的靶基因[15]，而miR-223對髓系分化發揮著重要的調節作用[16]。在許多t(8;21)陽性病人的白血病細胞中都發現有明顯的miR-223表達下調，這主要是由于AML1-ETO 招募去乙酰化酶和甲基化酶使得pre-microRNA基因組上游序列發生去乙酰化和超甲基化，使得染色體構型改變，導致了miR-223的表觀遺傳學沉默。RNAi干擾AML1-ETO或使用去甲基化治療都可以提高miR-223的表達水平，并恢復了細胞分化能力。因此AML1-ETO 可以通過對不同靶基因進行表觀遺傳學的修飾，改變染色體構型從而影響相關靶基因轉錄和阻滯細胞的分化。

2 融合蛋白AML1-ETO在人類急性白血病發生及發展中的作用

AML1-ETO一方面具有轉錄抑制作用，可以抑制一些與造血分化相關的重要轉錄因子、集落刺激因子受體以及其它重要蛋白如細胞周期蛋白的表達，導致了造血細胞分化的阻滯。同時AML1-ETO 在造血干細胞階段具有轉錄激活作用，可以轉錄活化部分與造血干細胞自我更新功能相關的基因，促進造血干細胞增殖，擴大造血干細胞池。有學者提出這樣的觀點：融合蛋白AML1-ETO一方面使一些原始的造血干細胞或前祖細胞增殖，即擴池作用；另一方面它阻滯這些原始細胞的分化，即關閉閘門作用；這樣使得原始的幼稚造血細胞越來越多，從而導致白血病的發生[4]。

但是，AML1-ETO的致白血病作用并非如此簡單，有報道發現在U937細胞系中過表達AML1-ETO融合蛋白導致細胞生長停滯并發生凋亡[17]。使用Knock-in或轉基因技術在小鼠中表達融合蛋白AML1-ETO后，會導致小鼠發生骨髓增生的紊亂，但并沒有白血病的發生[18]。因此單純的t(8;21)基因融合事件，產生融合蛋白AML1-ETO在白血病的發生中僅僅起著始動作用或只是上游或中游事件，染色體t(8;21)易位增加了基因組的不穩定性，可能使得基因組發生二次突變或二次打擊事件，加劇了AML1-ETO造成造血系統紊亂，最終導致急性白血病的發生。

2.1c-kit基因突變 C-Kit為Ⅲ型酪氨酸激酶家族成員之一。臨床數據表明，60%-80%的AML病人存在C-Kit的高表達，12.8%-46.8%的M2型AML病人存在c-kit基因的點突變[19]。在U937細胞中誘導表達AML1-ETO可以顯著上調C-Kit的mRNA和蛋白水平，導致C-Kit的活化，這可以解釋為什么在t(8;21)AML病人C-Kit的表達比其他白血病病人高出81.3%。這些現象可以得出這樣的推斷：t(8;21)陽性白血病的發生是分階段進行的：先是發生了t(8;21)基因融合產生融合蛋白AML1-ETO，融合蛋白的產生導致了酪氨酸激酶通路的異常活化，這可能是白血病發生的一次關鍵性的打擊事件，引發了急性白血病的迅速發生[20]。

2.2AML1-ETO截短體的發現 Yan等[21]在研究融合蛋白AML1-ETO的小鼠白血病造病過程中發現了AML1-ETO的截短體，該截短體缺失了C-末端的NCoR/SMRT反應結構域，并發現在小鼠體內過表達這種截短體可以迅速誘導白血病的發生。Yan等[22]發現t(8;21)陽性病人中存在一種AML1-ETO截短體：AML1-ETO9a，該截短體是由于在ETO基因中存在一個額外外顯子9a，這個外顯子的存在也導致C-末端剪切，產生了575個氨基酸組成的AML1-ETO融合蛋白。AML1-ETO9a也可以誘導小鼠白血病的發生，而且共同過表達全長的AML1-ETO和AML1-ETO9a也迅速誘導小鼠白血病的發生。

2.3caspase-3對AML1-ETO剪切作用對細胞凋亡敏感性的影響 Wang等[23]發現從疏花毛萼香茶菜(Isodoneriocalyx)植物中提取的萜類化合物eriocalyxin B可以顯著誘導t(8;21)白血病細胞凋亡，并通過caspase-3 降解融合蛋白AML1-ETO。Zhou等[24]發現冬凌草甲素也可以誘導t(8;21)白血病細胞凋亡，在U937細胞中過表達AML1-ETO會增加細胞對冬凌草甲素誘導的凋亡敏感性。冬凌草甲素主要也是通過caspase-3對AML1-ETO剪切，其剪切位點是第188位氨基酸。Lu等[1]在研究caspase-3對AML1-ETO的剪切在白血病細胞凋亡中的作用時發現，將AML1-ETO的caspase-3靶位點第188位和368位天冬氨酸突變為丙氨酸后，表達AML1-ETO的細胞對凋亡敏感性完全消失。

3 結語

綜上所述，融合蛋白AML-ETO 并非是通過單一通路導致白血病的發生，它的作用可能是通過多方面、多因素、多步驟的影響，或者類似于信號通路級聯放大作用，從而觸動急性白血病的猝發。但染色體易位產生融合基因AML1-ETO是白血病發生的一個重要始動因素，沒有它也就沒有下游基因或染色體改變事件，因而也不會有白血病的發生。當然也不排除可能在發生染色體易位前基因組已經發生了一些目前我們尚未發現的基因損傷或改變事件，引發了t(8;21)的染色體易位并伴隨發生染色體的其它重要基因突變事件，遂導致了白血病的發生，這也可以用來解釋為什么將體外重組的融合基因AML1-ETO轉導到小鼠體內并不能導致白血病的發生。由此可見，融合蛋白AML1-ETO導致白血病發生的機制十分復雜，有待于我們進一步深入研究。

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BiologicalfunctionandcancerogenicmechanismofAML1-ETOfusionprotein

LIU Xiao-xiao1,2, ZHANG Bo1, ZHAO Qian1

(1DepartmentofPathophysiology,ShanghaiJiaotongUniuersitySchoolofMedicine(SJTU-SM);2InstituteofHealthSciences,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences/SJTU-SM,Shanghai200025,China.E-mail:qzhao@shsmu.edu.cn)

AML1-ETO fusion protein is the product of (8; 21) translocation in M2 type acute myelocytic leukemia (AML). As a transcription repressor, AML1-ETO can block the differentiation of hematopoietic cells by repressing the expression of some important hematopoiesis-related transcription factors. Recent results indicate that the fusion protein also induces the epigenetic silencing of some target genes, resulting in the delay of hematopoietic maturation. Moreover, AML1-ETO promotes the proliferation of hematopoietic stem cells through up-regulating the expression of Jagged1 and miR-24. Meanwhile, a panel of results in the pathogenesis of AML1-ETO show that the expression of AML1-ETO alone can not induce AML. The secondary events or hits likec-kitgene mutation and the AML1-ETO9a truncation play an important role in leukemogenesis of AML1-ETO-positive cells.

AML1-ETO融合蛋白; 轉錄阻遏; 造血干細胞; 二次打擊事件

AML1-ETO fusion protein; Transcription repressor; Hematopoietic stem cells; Secondary hits

R363

A

1000-4718(2011)03-0603-04

2010-06-13

2010-11-16

國家自然科學基金資助項目(No.30870979)；上海科委基礎研究重點資助項目(No.08JC1413500)

△通訊作者 Tel：021-64154900； E-mail：qzhao@shsmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.037