PTEN、MRP在非小細胞肺癌組織中的表達及生物學意義

翟展藝 蔣軍廣 翟建霞 田 蕊 趙 娜

(鄭州大學第一附屬醫院 河南省呼吸疾病研究所 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

肺癌發病率及死亡率在近10年來呈明顯上升的趨勢，60%～80%的肺癌患者在診斷時已屬晚期，治療多采用以化療為主的綜合治療。張力蛋白同源的磷酸酶基因(PTEN)是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，多藥耐藥相關蛋白(MRP)是一種新的多藥耐藥相關蛋白基因。有關PTEN、MRP在肺癌發病機制中的作用尚存在爭議。本實驗檢測不同組織類型、分化程度、臨床分期及預后的肺癌組織標本中PTEN、MRP的表達，旨在探討PTEN基因表達及細胞增殖凋亡在肺癌發生發展中的作用，以及MRP陽性表達與肺癌臨床病理改變之間的關系。

1 對象和方法

1.1 標本 2002年9月至2006年11月在我院住院手術切除的肺癌患者 55例，男 42例，女 13例，年齡 36～81〔平均(58.93±21.96)〕歲。所有患者術前均未行放療和化療。標本均經病理證實，鱗癌31例，腺癌24例。根據1997年國際抗癌協會提出的TNM分期標準進行分期，ⅠA期0例，ⅠB期11例，ⅡA期1例，ⅡB期13例，ⅢA期15例，ⅢB期12例，Ⅳ期3例。對照組選擇22例癌旁正常肺組織(距癌組織3 cm以上)。所有標本均為甲醛固定、石蠟包埋。連續4μm厚切片。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗人PTEN多克隆抗體，鼠抗人MRP單克隆抗體，免疫組化法(S-P)通用試劑盒及二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 采用S-P法，主要步驟如下:石蠟切片脫蠟水化，于檸檬酸緩沖液中行微波抗原修復，過氧化物酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶活性，非免疫性動物血清阻斷非特異性反應，滴加兔抗人PTEN多克隆抗體，鼠抗人MRP單克隆抗體，4℃過夜，加生物素標記的第二抗體，加鏈霉抗生物素-過氧化物酶溶液，DAB顯色后自來水充分沖洗，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。

1.2.3 結果判定 PTEN蛋白主要定位于細胞質，細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性。從以下兩方面進行定量判斷:①陽性著色:無色為0分，淡黃色1分，棕黃色3分;②陽性細胞數:5個高倍視野在每張切片上計算1 000個以上癌細胞，陽性細胞數10% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～100%為3分。兩類分數乘積，3分以下為陰性“－”，3分為弱陽性“+”，4分以上為強陽性“?”。MRP蛋白以胞質和胞膜呈棕黃色為陽性細胞。首先根據陽性細胞數目判斷:高倍鏡下隨機選擇腫瘤細胞密集區觀察500個瘤細胞，計算其陽性細胞占腫瘤細胞的百分比。無陽性細胞為陰性，1分為陽性細胞數≤10%;2分為11% ～50%;3分為51% ～75%;4分為＞75%。再按染色強度計分:1分為淺黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。以兩者乘積為最后得分:≥3分為陽性，＜3分為陰性。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，行χ2檢驗。

2 結果

2.1 PTEN在正常肺組織及肺癌原發灶中的表達及其與臨床病理特征的關系 23例正常肺組織中PTEN陽性表達率為86.95%(20/23)，55例肺癌組織中的陽性表達率為63.63%(35/55)，差異有統計學意義(χ2=4.242，P=0.03)。非小細胞肺癌(NSCLC)高、中分化PTEN陽性表達率為88.57%，低分化為20.00%，差異具有統計學意義(χ2=25.861，P ＜0.01)。TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期PTEN陽性表達率92.00%，Ⅲ、Ⅳ期為40.00%，差異有統計學意義(χ2=15.934，P＜0.01)。有淋巴結轉移者 PTEN陽性表達率50.00%，無淋巴結轉移者為94.11%，差異有統計學意義(χ2=9.879，P＜0.01)。PTEN的表達與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的臨床類型、病理類型、腫瘤大小等均無關(均P＞0.05)。

2.2 MRP在正常肺組織及肺癌原發灶中的表達及其與臨床病理特征的關系 23例正常肺組織中陽性表達率為34.78%(8/23)，55例肺癌組織中的陽性表達率為83.63%(46/55)，差異有統計學意義(χ2=18.171，P=0.000)。鱗癌中MRP陽性表達率93.00%，腺癌中為70.83%，差異有統計學意義(χ2=5.1，P＜0.05)。PTEN的表達與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的臨床類型、病理類型、分化程度、TNM分期、腫瘤大小等均無關(均P＞0.05)。

3 討論

1997年發現的PTEN是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，該基因定位于第10號染色體q23.3，由9個外顯子和8個內含子組成。PTEN基因具有雙重磷酸酶的特異性，對蛋白質去磷酸化，特異地去除PIP3上的磷酸基團，然后分別通過抑制體內蛋白激酶B(PKB)和抑制黏附斑激酶(FAK)途徑，對細胞增殖和凋亡進行負調節〔1，2〕。PTEN還可直接抑制細胞內PKB活性，阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和細胞信號轉導途徑，抑制細胞生長分化。PTEN可使FAK去磷酸化，從而抑制黏附斑復合物所介導的細胞浸潤、生長分化。

本研究中肺癌組織PTEN的蛋白表達顯著低于癌旁正常肺組織，肺癌PTEN表達降低，提示PTEN蛋白的低表達在肺癌的發生中可能起重要作用。PTEN蛋白陽性表達率與肺癌病理組織學類型無關，而與分化程度以及淋巴結轉移有關。中高分化癌陽性表達率明顯高于低分化癌，PTEN蛋白失表達在有淋巴結轉移的NSCLC中明顯高于無淋巴結轉移者，差異有統計學意義。提示PTEN表達下調與NSCLC的浸潤轉移密切相關〔3〕，這可能與其脂質磷酸酶活性有關，故PTEN通過使FAK去磷酸化抑制細胞的侵襲和轉移〔1〕。PTEN有可能成為判斷肺癌分化程度、轉移及預后的指標。

MRP是由王寧〔4〕1992年在不表達 P-gp的人小細胞系H69AR中分離出的一種新的耐藥基因蛋白，定位于16號染色體 p13.1，相對分子質量為 190×103，稱 MRP。MRP與mdr/P-gp同屬ATP結合盒式蛋白(ABC)超家族膜轉運蛋白，也是ATP依賴的跨膜蛋白〔5〕。Wright采用免疫熒光檢測肺癌組織中的MRP表達，發現其主要定位于細胞膜上;同時，在正常支氣管上皮細胞及混合腺中也能見到其表達于基側膜上，表明MRP主要存在于細胞膜上，但也有少量存在于細胞質中。MRP主要功能有兩種:①位于細胞膜發揮藥物外排泵的作用，主要通過協同機制轉運結合還原型谷胱甘肽的藥物。MRP作為一種ATP能量依賴的耦合輸出泵(GS-X)，當抗腫瘤藥物在谷胱甘肽轉移酶的作用下與谷胱甘肽形成共軛物GS-X時，通過泵功能將GS-X迅速泵出細胞外，使細胞內藥物濃度迅速下降，產生耐藥。②位于細胞質內形成囊泡包裹藥物，起隔離作用，避免藥物損傷細胞核。本研究結果顯示，MRP在肺癌中的檢出率為83.63%，與文獻相符〔6〕。MRP在腺癌中的陽性表達率較鱗癌中低，提示MRP可能與NSCLC的發生及病理類型有關。

1 Tamura M，Gu J，Matsurmoto K，et al.Inhibition of cell migration.spreading and focal adhesions by tumor suppressor PTEN〔J〕.Science，1998;280(5369):1614-7.

2 Schondorf T，Becker M，Gohring UJ，et al.Interaction of cisplatin，paclitaxel and adriamycin with the tumor suppressor PTEN〔J〕.Anticancer Drugs，2001;12(10):797-800.

3 廖曉波，胡冬煦，周新民，等.利用組織微陣列結合免疫組化法研究PTEN，P16，P21，P53在肺癌組織中的表達及其臨床意義〔J〕.癌癥，2004;23(3):334-8.

4 王 寧，楊海山，劉 潔，等.人肝癌多藥耐藥細胞系BEL-7402/ADM的建立及耐藥相關基因表達檢測〔J〕.吉林大學學報(醫學版)，2005;31(3):361-4.

5 Drug D，Filippov DV，Hermanns R，et al.Peptidomimetic glutathione analogues as novel gamma GT stable GST inhibitors〔J〕.Bioorg Med Chem，2002;10(1):195-205.

6 Souslova T，Averill-Bates P.Multidrug-resistant hela cells overexpressing MRP1 exhibit sensitivity to cell killing by hyperthermia:interactions with etoposide〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004;60(5):1538-51.