魚類小肽轉運載體PepT1研究進展

飼料安全與高效利用教育部工程研究中心 黎航航 陳立祥

湖南農業大學動物醫學院 蘇建明*

小肽轉運蛋白是小肽吸收的載體，目前在動物體類發現的小肽轉運蛋白至少有5種（Leibach和Ganapathy，1996），其中PepT1是研究最為廣泛的一種。近年來，編碼小肽吸收轉運載體活性蛋白質的基因已被克隆，在小肽的吸收機制、營養作用和生理活性等方面取得了重大研究進展。國外對魚類的小肽轉運載體基因研究較早，而國內目前對PepT1的研究主要集中在哺乳動物上，而對魚類這方面的研究還較少。在魚類中已有斑馬魚（Daniorerio，AY300011），China rockfish（Sebastesnebulosus，EU160494），大西洋鱈 魚（Gadus morhua，AY921634）和歐洲黑鱸（Dicentrarchus labrax，FJ237043），鯉魚（Cyprinuscarpio，EU328390）等魚類的PepT1基因被克隆出來并測序分析（葉萬里和李英文，2009），并對其吸收機制作了一定的研究。

1 魚類小肽的吸收機制

1.1 魚類小肽轉運特點 轉運蛋白的生理重要性通常由兩個術語來描述，一是它們識別和結合底物分子的相對能力（即親和力）；另一個是底物通過膜被轉運的數量和速度（即容量或速度）（孫建義等，2002）。經許多研究證實，PepT1是低親和力/高容量的肽轉運載體，PepT2是高親和力/低容量的肽轉運載體（Daniel，2004）。 對魚類來說，小肽的整個轉運過程與哺乳動物基本相似，即：（1）通過低親和力/高容量的轉運載體識別和結合肽；（2）通過細胞的刷狀緣膜轉運進入胞液，并水解為游離氨基酸；（3）通過高親和力/低容量的基底膜轉運載體把完整的肽轉運進入血液（Kottra等，2002）。但是魚類又有自己的特點，魚類PepT1最大轉運電流存在pH依賴性，而且在刷狀緣膜上同時存在高、低兩種親和力轉運系統，以及在基底膜上存在低親和力/高容量的轉運系統，而該轉運系統顯示了比刷狀緣膜上的轉運系統更廣泛的底物結合能力（Thamotharan 等，1999）。

1.2 魚類PepT1轉運的動力學特征 Verri等（2000）通過測定脯-丙二肽D-[3H]-Phe-L-Ala的吸收和用pH敏感物染料吖啶橙監測肽的內胞膜酸化依賴性來對鰻鱺小腸刷狀緣膜囊泡（BBMVs）的H+/肽的協同轉運進行了研究，用二肽對BBMVs進行預孵以阻止DEPC對轉運活動的抑制，這表明，底物（二肽）能屏蔽涉及載體催化功能的組氨酸殘基。用人類PepT1特異性引物對鰻鱺小腸進行RT-PCR信號檢測，結果表明，在鰻鱺小腸內刷狀緣膜囊上，存在一個低親和力型的H+/肽的協同轉運系統，并且它的動力學特征和哺乳動物小腸的PepT1型轉運系統相似。Verri等（2003）又以哺乳動物的高親和力兩性甘-谷二肽（Gly-L-Gln）為底物，利用雙電極電壓鉗技術（TEVC）來確定斑馬魚轉運的基本動力學特征。結果表明，在總體上，斑馬魚的PepT1與直系同源物哺乳動物的相似，是低親和力/高容量轉運載體。在相同的試驗條件下，斑馬魚的轉運過程與兔子的沒有顯著差異。TEVC試驗中的兩個基本動力學參數K 0.5（二肽表觀親和力）和Imax（最大轉運電流），兔和斑馬PepT1的Gly-L-Gln的K0.5在毫摩爾計量內是相似的。事實上，在-60 mV，pH值7.5，斑馬魚的PepT1 K 0.5是1.06 mmol/L。兔的PepT1K0.5是 0.70 mmol/L； 而在-120 mV，pH值7.5，斑馬魚的PepT1 K0.5是0.55 mmol/L，兔的PepT1 K0.5是0.42 mmol/L。然而，與高級脊椎動物相比對方的最大轉運活力是不依賴細胞外的pH值的。通常，Imax是依賴膜電位的，在任何pH值下，其值從-160 mV穩定地向更低的負電位減少，然而，當斑馬魚細胞外pH值從6.5上升至8.5時，Imax顯著增加，據了解，這是第一次發現這種動力學特征類型的PepT1，在之前任何脊椎動物PepT1蛋白中都未有過報道。因此，盡管存在這各種相似之處，但斑馬魚的PepT1與其他已知哺乳動物的轉運蛋白的動力學行為還是存在不同，斑馬魚PepT1 Imax的pH依賴性成為其小肽轉運載體的獨有特征。

Sangaletti等（2009）對鱸魚的 PepT1轉運功能進行了研究，把pH依賴性的寡肽轉運蛋白Pept1注入到非洲爪蟾屬卵母細胞中進行電生理研究，結果表明，鱸魚PepT1在缺乏底物的情況下還是存在前穩態電流，米氏方法分析傳輸電流顯示在酸性pH下，底物表觀親和力增加，這和斑馬魚的PepT1非常相似，但是相反的是，pH并沒有顯示出對最大轉運電流存在顯著影響。R?nnestad等（2010）對大西洋鮭的 PepT1的分子克隆以及功能表達等方面的進行了研究，利用TEVC技術，以兩性水解性二肽Gly-Sar作為測試底物在非洲爪蟾卵母細胞內來確定鮭轉運的基本動力學特征。特性曲線關系的初始計量在卵母細胞內定在-60 mV，在細胞外pH為6.5，Gly-Sar濃度分別為 0.1、0.5、10 mmol/L的條件下孵化，在pH為6.5時，內部轉運電流指示為負膜電位，而逆向電流卻為給多的正膜電位。而后用細胞外Gly-Sar濃度為 0.1～20 mmoL/L，pH值分別為6.5、7.5和8.5來確定K 0.5與Imax，分析顯示K 0.5與Imax對pH和膜電位都有依賴性，膜電位和pH對K0.5有很強的影響。而正如電轉運預期的那樣，Imax也存在膜電位依賴性，在任何pH下，它的值也穩定地從-160 mV向更低的負膜電位減小。而當細胞外pH從6.5變成8.5的時候，Imax也有略微升高，這與之前報道的斑馬魚PepT1轉運蛋白一致（Verri等，2010）。這也表明雖然魚與哺乳動物PepT1有一些相似之處，但魚與哺乳動物轉運機制確實也存在著不同，哺乳動物的最大轉運活力與胞外pH是沒有關系的（胡夢紅和王有基，2007）。

2 魚類PepT1基因的克隆及其分子特征

目前已有多種魚的PepT1基因被克隆，但多見于國外報道，國內只見報道了對鯽魚基因的克隆。Verri等在2003年克隆出了斑馬魚的PepT1基因，這是第一種被克隆出的魚，通過對斑馬魚的PepTl基因進行序列分析得到，斑馬魚PepTl cDNA全長2746 bp，其中開放閱讀框（ORF）長2157 bp，編碼一個由718個氨基酸殘基組成的蛋白質。親水性分析預測斑馬魚PepT1至少有12個膜電位跨膜域，并且在跨膜區9和10之間有一個大的外環。有6個膜外N-糖基化位點，有2個膜內含蛋白激酶C基序的相同區域以及1個已鑒定的膜內cAMP依賴的蛋白激酶列。R?nnestad等（2007b）克隆了大西洋鱈魚的PepT1的基因，大西洋鱈魚的 PepTl cDNA全長 2838 bp，ORF長2190 bp，編碼一個由729各氨基酸殘基組成的蛋白質。親水性分析預測鱈魚也有12個膜電位跨膜域，在跨膜區9和10之間有一個大的外環。另外有 5個膜外N-糖基化位點，3個膜內 cAMP／cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，但沒有蛋白激酶C的磷酸化位點。R?nnestad等（2010）又報道了大西洋鮭魚的PepT1的基因的信息。其cDNA全長2629 bp，ORF長為2205 bp，編碼蛋白由734個氨基酸殘基組成。也是12個膜電位跨膜域，跨膜區9和10之間有一個大的外環。4個膜外N-糖基化位點，3個膜內cAMP／cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點，3個蛋白激酶C磷酸化位點。

國內只見對鯽魚的PepT1基因的克隆，熊鋼（2010）的研究結果得出，PepTlDNA全長 2346 bp， 包含 149 bp 的 5’UCR，343 bp 的 3’UCR，1854 bp的開放閱讀框，編碼617個氨基酸組成的蛋白質。分子質量為6.8974 kD，等電點為5.9。分析鯽魚與10個物種的基因同源性、氨基酸跨膜區同源性和預測編碼的氨基酸同源性得出：PepT1cDNA基因全長與鯉魚同源性高達99.2%，與斑馬魚、泥鰍和鰭魚的同源性分別為：76.1%、82.6%、60.6%，與哺乳動物的同源性為54.0% ～58.4%；其基因編碼區序列和氨基酸序列相對保守，在基因編碼區鯽魚與哺乳動物的基因同源性為61.7%～74.0%。

3 魚類PepT1基因的組織表達

魚類的消化系統較畜禽要簡單，大多數魚類只有一段消化道，因此，通常將魚類的消化道分為前、中、后腸。 Verri等（2003）以及 R?nnestad 等（2007a）通過設計PepT1特異性引物，利用RTPCR（逆轉錄聚合酶擴增反應）從成年斑馬魚和鱈魚的腸道，脾和腎的總RNA中分別擴增了長度為772 bp和681 bp的DNA產物，而在眼、心臟、肝臟與鰓中都未見有擴增產物。R?nnestad（2010）利用qPCR（定量聚合酶鏈擴增反應）測得PepT1基因在腸道中表達很高，大腦中較低，而在皮膚心臟中基本沒有。熊鋼（2010）的研究認為，PepT1在鯽魚組織表達的高低順序依次為：前腸、中腸、后腸、心臟、腎臟、肌肉、腦和肝臟。這表明魚類的PepT1基因主要分布在消化道，這可能是由于小肽的主要吸收部位是腸道所導致的。

PepT1基因在不同部位、不同的日糧條件或不同發育時期下表達都是不一樣的。Ostaszewska等（2010）研究了以植物性蛋白質為基礎日糧補充小肽和氨基酸對鯉魚PepT1基因表達的影響。在以小麥面筋提供蛋白的基礎日糧中分別添加Lys-Gly，游離 Lys、Gly，以及不添加 Lys進行飼養試驗。結果表明，飼喂添加Lys-Gly日糧的鯉魚PepT1基因表達量最高，表達最低的為未添加Lys日糧組。這表明在日糧中添加一定量的小肽會加強PepT1基因的表達量，并且有利于消化道的發育與代謝。Bakke等（2010）分別以魚幽門盲囊（S1），不同腸段（分為 S2、S3、 S4 、S5）的 PepT1 基因表達量作為評估指標研究了蛋白水解物以及游離氨基酸對PepT1基因表達的影響。結果顯示，在所有腸段中均發現有PepT1基因的表達，這表明所有腸段都參與了小肽吸收，但是又存在差異。飼喂魚粉的魚其S5段比S2段表達量少；而游離氨基酸組和超濾魚粉水解物組的魚其S2和S3腸段的PepT1 mRNA水平要高于其他區域段。這些數據表明，整個小腸的PepT1表達是變化的，也包括最遠端部分，以應對腸道內蛋白內容物的變化。這個適應性反應可能是為了保持腸道水平的最大蛋白質吸收效率（Terova等，2009）。

Amberg等（2008）通過原位雜交技術和實時定量PCR來確定大西洋鱈魚幼魚攝食野生浮游動物或輪蟲時PepT1基因的時空表達模式。試驗結果顯示，PepT1mRNA在胚胎孵化時（先于外源性攝食）就已有表達。開始外源性攝食后，在除了食管和括約肌以及肛門區域外的消化道，均觀察到有較強PepT1表達。孵化后22 d，PepT1基因延續高水品的表達。

4 結語

蛋白質在胃和小腸經消化酶作用后的最終產物為游離氨基酸和小肽，分別由氨基酸轉運載體和小肽轉運載體吸收轉運進入體內。小肽轉運載體對動物的營養有重要意義。PepT1就是其中一種很重要的小肽轉運載體。現已有多種魚類的PepT1基因被克隆出來并測序分析，并通過各種定量PCR等方法對其組織分布與表達作了報道。但是對魚類小肽的吸收機理還有待進一步研究。這將為優化魚類飼料配方，提高魚類養殖的經濟效益產生重要影響。

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