植物黃酮作為飼料添加劑的安全性評價研究進展

東北農業大學動物營養研究所 馮香安 劉紅南 劉瑩 張琳 金芳 劉延國 李垚*

黃酮類化合物（flavonoids），又名生物類黃酮化合物（bioflavonoids），簡稱類黃酮，亦稱維生素P，由于廣泛存在植物中，又稱植物黃酮類化合物；是一類重要的天然酚類化合物，屬于植物次級代謝產物；泛指具有色酮環與苯環為基本結構的一類化合物的總稱，其基本骨架具有C6-C3-C6的特點，即由兩個芳香環A和B，通過中央三碳鏈相互連結而成的一系列化合物。根據其結構特點，可將黃酮類化合物分為黃酮、黃酮醇、黃烷醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、花色素、查爾酮、雙黃酮等（Lwashina，2000）。由于黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血壓以及預防心血管疾病和骨質疏松、治療腹瀉等功能，對動物的生產性能也有明顯的促進作用，近年其研究與利用倍受關注。

本文綜述了近年來國內外有關植物黃酮類化合物的安全評價研究進展，對安全合理地利用植物黃酮類化合物具有一定的指導意義。

1 植物黃酮類化合物的毒理學研究

1.1 一般毒性試驗 外源化學物在一定劑量、一定接觸時間和接觸方式下對試驗動物產生的綜合毒效應稱為一般毒性（general toxicity），又稱為基礎毒性（basic toxicity），一般毒性研究主要揭示外源化學物與動物之間的量效關系，根據接觸毒物的時間長短又分為急性毒性試驗、亞慢性和慢性毒性試驗。

1.1.1 急性毒性試驗 急性毒性是指試驗動物一次接觸或24 h內多次接觸某一化學物所引起的毒效應，甚至死亡。目的是了解受試物的毒性強度和性質，為蓄積毒性和亞急性毒性試驗的劑量選擇提供依據。致死劑量通常用半數致死劑量LD50來表示，其單位是每千克體重所攝入受試物質的毫克數，即 mg/（kg·BW）。

大量急性毒性試驗表明，植物黃酮類化合物在適當劑量下是無毒的。司紅麗等（2003）在狗舌草總黃酮的提取及其毒性試驗中測得狗舌草總黃酮的 LD50值為（1392.52±94.62） mg/（kg·BW），屬于中等毒性，表明狗舌草總黃酮的毒性很低。李立等（2010）在大豆異黃酮復合膠囊毒理學安全性評價試驗中采用最大耐受劑量法，劑量為10.0 g/（kg·BW），測得大豆異黃酮復合膠囊雌、雄小鼠經口急性毒性試驗最大耐受劑量（MTD）＞10.0g/（kg·BW），屬實際無毒級物質。虞穎映（2006）對羅布麻茶食品安全性的系統性毒理學試驗研究結果表明，羅布麻葉提取物對試驗動物大、小鼠的經口急性 LD50均大于 10.0 g/（kg·BW），屬實際無毒級物質。唐浩國等（2007）在麻竹葉黃酮的毒理學試驗中研究表明，竹葉總黃酮經口LD50＞21.50 g/（kg·BW），屬實際無毒級物質。沈繼紅和張愛軍（2006）在葡萄多酚的毒性試驗中測得急性毒性半致死濃度為 LD50＞ 10 g/（kg·BW），屬實際無毒級物質。隋海霞（2009）在芹菜素（又稱芹黃素，是天然存在的一種黃酮類化合物）安全性和降血壓作用及其機制的試驗研究中測得大鼠經口急性毒性試驗的 LD50＞ 8 g/（kg·BW）， 根據急性毒性試驗結果分級，芹菜素屬實際無毒級物質。Shoji等（2004）研究蘋果多酚（apple polyphenol，AP）對大鼠的經口急性毒性，試驗大鼠未表現不良癥狀，試驗結果顯示，AP的最小致死劑量大于2000 mg/（kg·BW）。 Féres等（2006）研究了巴西豆科植物DMB（Dimorphandra mollis Benth，DMB）的水醇提取物（含76%蘆?。π∈蟮募毙远拘?，試驗小鼠有輕微可恢復的異常癥狀，結果顯示DMB的水醇提取物的 LD50＞ 5000 mg/（kg·BW）。 Nagasako-Akazome 等（2007）對蛇麻素（lupulin）進行安全性評價，急性毒性試驗顯示2000 mg/kg劑量未引起大鼠的死亡，綜合觀測數據沒有顯著的統計學意義。通過這些急性毒性試驗可以看出，這些植物黃酮類化合物在適當的劑量下是安全的。

1.1.2 亞慢性試驗與慢性毒性試驗 亞慢性毒性（也叫亞急性毒性試驗）是指試驗動物連續（通常1～3個月）重復染毒外源化學物所引起的毒性效應；慢性毒性是指試驗動物長期染毒外源化學物所引起的毒性效應。目的是觀察受試物以不同劑量水平較長期喂養對動物的毒性作用性質和靶器官，并確定最大無作用劑量。

在大豆異黃酮復合膠囊大鼠30 d喂養試驗中，雌、雄性大鼠低、中、高劑量組的體重、進食量、食物利用率、臟器重量和臟器系數、血液生化和細胞學及病理組織學等各項指標與對照組比較差異均無統計學意義，說明大豆異黃酮復合膠囊在該劑量范圍內是安全的（李立等，2010）。在對羅布麻茶食品安全性的系統性毒理學試驗研究中，30 d短期喂養試驗結果表明，其對試驗動物的生長情況、血液學生化指標、主要臟體比及組織學皆無潛在的毒性作用（虞穎映，2006）。在葡萄多酚的毒性試驗中對葡萄多酚樣品喂養大鼠試驗表明，30 d內大鼠生長發育良好，各試驗組動物體重、體重增加，進行量、食物利用率、血常規、血生化以及臟器系數等各項指標均在正常值范圍內，與對照組之間差異無顯著性（沈繼紅和張愛軍，2006）。在芹菜素安全性和降血壓作用及其機制的試驗研究中以0、2、4、6、8 g/kg 芹菜素喂飼大鼠 13 周，各劑量組體重、進食量、食物利用率、血常規、血生化以及臟器系數等各項指標與對照組比較，差異均無顯著性（P ＞ 0.05）（隋海霞，2009）。 在研究 DMB 的水醇提取物對大鼠的180 d慢性毒性中，試驗結果顯示，1000 mg/kg劑量組沒有任何臨床反應，2000 mg/kg劑量組在試驗初期有豎毛、活動減退等癥狀，4 d后癥狀消失，在試驗第31～42天出現輕微變化如呼吸困難、疲勞、衰弱等，試驗期間所有受試動物無一例死亡（Féres等，2006）。在進行蛇麻素（lupulin）的90 d亞慢性毒性試驗中，臨床評價沒有發現明顯的毒性效應，試驗認為蛇麻素的無不良反應劑量（NOAEL）值為每天2000 mg/（kg·BW）（Nagasako-Akazome 等，2007）。 綜合以上試驗結果可知，植物黃酮類化合物在適當劑量下不會在長時間的飼喂中產生毒副作用。

1.2 蓄積毒性試驗 外源化學物進入機體后，經過代謝轉化排出體外，或直接排出體外。但是當其連續地、反復地進入機體，而且吸收速度超過代謝轉化與排泄的速度時，化學物質在體內的量逐漸增加，稱為化學物質的蓄積作用（accmulation）。外源化學物的蓄積作用是發生慢性毒性的基礎。慢性毒性可以是因外源化學物或其代謝產物的物質蓄積，但有的化學物質，經長期接觸后在機體內測不出該化學物質的原形或其代謝產物，可卻出現了慢性毒性作用時，稱之為損傷蓄積（也有稱為功能蓄積）。根據有關規定如果LD50＞10 g/（kg·BW）者，則可不需要進行蓄積毒性試驗（中華人民共和國衛生部，2004）。由急性毒性試驗可知，多數植物黃酮類化合物的LD50都大于10 g/（kg·BW）。因此，蓄積毒性試驗在植物黃酮類化合物的安全評價中很少見。

1.3 致突變性試驗 致突變性（mutagenicaction）是指外來因素引起細胞核中的遺傳物質發生改變的能力，而且這種改變可隨同細胞分裂過程而傳遞。常用的檢驗化學致突變作用的試驗主要有骨髓微核試驗、精子畸形試驗、染色體畸變試驗、Ames試驗等。

在大豆異黃酮復合膠囊毒理學安全性評價試驗中進行Ames試驗表明，各劑量組在加S-9或不加S-9條件下，均未引起回復突變菌落數明顯增加，大豆異黃酮復合膠囊Ames試驗結果為陰性；小鼠骨髓細胞微核試驗表明，陽性對照組與溶劑對照組比較差異顯著（P＜0.01），各劑量組微核率與溶劑對照組比較無顯著差異（P＞0.05），小鼠骨髓細胞微核試驗陰性；小鼠精子畸形試驗表明陽性對照組精子畸形率與溶劑對照組比較差異顯著（P＜0.01），大豆異黃酮復合膠囊各劑量組精子畸形率與溶劑對照組比較無顯著差異（P＞0.05），小鼠精子畸形試驗陰性（李立等，2010）。在對羅布麻茶食品安全性的系統性毒理學試驗研究中進行小鼠骨髓細胞微核試驗表明，樣品各劑量組小鼠嗜多染紅細胞微核率與陰性對照組比較，差異無統計學意義，即樣品微核試驗結果為陰性；精子畸形試驗表明樣品各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組相比較，經X2檢驗差異無統計學意義（P＞0.05）；而陽性組與陰性組比較差異有統計學意義（P＜0.01），即樣品精子畸形試驗結果為陰性（虞穎映，2006）。在麻竹葉黃酮的Ames試驗結果中表明，麻竹葉黃酮的6個測試濃度在加S-9或不加 S-9活化的情況下，4個菌株 TA97、TA98、TA100和TA102的回變菌落數均與陰性對照組很接近，沒有顯著性差異（P＞0.05）且沒有超過陰性對照組的2倍，而與陽性對照組比較要低得多，有極顯著性差異（P＞0.01），因此，竹葉黃酮不能使鼠傷寒沙門氏菌移碼突變株和堿基置換突變株發生回復突變的現象；竹葉黃酮的骨髓微核試驗結果表明，陽性對照組（環磷酰胺）具有微核嗜多染色紅細胞數與陰性對照組（竹葉黃酮0.00 g/kg）相比，差異極顯著（P＜0.01），竹葉黃酮的各劑量組小鼠具有微核嗜多染紅細胞率與陰性對照組相比，微核率值非常接近，無顯著差異（P＞0.05），且無劑量-效量關系，因此，竹葉黃酮沒有對小鼠骨髓細胞染色體的斷裂效應及紡錘體毒效應；竹葉黃酮的小鼠精子畸形試驗結果表明，陽性對照組（環磷酰胺）小鼠精子畸形率與陰性對照組（竹葉黃酮 0.00 g/kg）相比，差異極顯著（P ＜ 0.01）。竹葉黃酮的各劑量組小鼠精子畸形率與陰性對照組相比，小鼠精子畸形率非常接近，無顯著差異（P＞0.05），且無劑量-效量關系，揭示竹葉黃酮對小鼠精子的畸形無影響（唐浩國等，2007）。在葡萄多酚的毒性試驗中進行Ames試驗，結果表明該受試物各劑量組回變菌落數均未超過溶劑對照菌落數2倍，亦無劑量-反應關系，說明在加與不加S-9時受試樣品對鼠傷寒沙門氏菌 TA97、TA98、TA100和TA102四株試驗菌株均未出現遺傳毒性，測試為陰性；小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核和精子畸形試驗表明，各劑量組微核率、精子畸形率與陰性對照組相比，均無顯著差異，而環磷酰胺陽性對照組與陰性對照組比較，差異顯著（P＜0.01）（沈繼紅等，2006）。在蛇麻素的研究中，Ames試驗和微核試驗結果均表明其無致突變性和遺傳毒性（Nagasako-Akazome 等，2007）。 以上試驗結果表明，植物類黃酮化合物在適當劑量下不會引起細胞核中的遺傳物質發生改變，即無致突變性。

2 小結

綜上所述，大部分毒理學研究提示植物黃酮類化合物一般無毒，但目前尚不完全清楚其作用機制，有必要對其展開系統研究，為植物黃酮類化合物的合理科學利用提供科學依據。植物黃酮類化合物在植物中廣泛分布，利用我國豐富的植物資源從中提取具有多種生物活性和無毒的植物黃酮作為飼料添加劑，是安全可行的，并將具有廣闊的前景。

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