雌二醇可降解涂層支架置入后對犬冠狀動脈內膜增生的影響

宋春莉,張基昌,李楊雪,劉 斌,崔曉倩,李智博,史永峰

（吉林大學第二醫院,吉林 長春 130041）

冠狀動脈支架置入術后再狹窄一直是冠心病介入治療研究中的重中之重,其中以冠脈內支架涂層的研究尤為突出。目前應用的藥物涂層支架如雷帕霉素與紫杉醇涂層支架,在阻止平滑肌細胞增生的同時也阻止血管內皮細胞增生,使支架被內皮細胞覆蓋時間過長或難以被覆蓋,容易形成血栓[1,2]。通過加速內皮化已被證實可降低再狹窄及支架內血栓形成,是最具前景的研究方向[3]。雌激素具有復雜多樣的生理作用,體外研究已證實雌激素能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移,而作用于內皮細胞時則可促進其增殖和遷移[8]。根據此特點,本研究通過構建載雌激素可降解涂層支架,期望加速受損內膜修復的途徑來實現消除再狹窄,動物實驗評價其安全性及有效性,為新型血管支架的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物 雜種犬15條（由吉林大學動物實驗中心提供）,重20-25 kg。隨機分為3組,雌二醇涂層支架組,聚乳酸（PLA）涂層支架組,裸支架組,每組5只。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 316L不銹鋼裸支架（購自樂普醫療器械股份有限公司）;聚乳酸（中國科學院長春應用化學研究所提供）;氯吡格雷（波立維,賽諾非公司）;HE染色劑;17-β雌二醇（購自sigma公司）;枸橡酸鈉;甲醛等。

1.2.2 實驗步驟 采用共混的方法制備雌二醇涂層支架。術前1日給予阿司匹林100 mg,氯吡格雷75mg,術晨禁食。動物麻醉采用速眠新,肌肉注射0.1 ml/kg,術中適當追加,總量＜0.2 ml/kg。支架用手捏方法捆綁于球囊上,行冠狀動脈造影,隨機選擇左前降支、左回旋支和右冠狀動脈的合適血管段,定量冠狀動脈造影（QCA）測定其直徑,根據參考血管直徑,用帶支架球囊以球囊/血管1.3∶1的比例,用10-15大氣壓、15 s單次過度擴張血管形成冠狀動脈損傷模型并置入裸支架或PLA涂層支架或雌二醇涂層支架,術后常規復查冠狀動脈造影示血管通暢。術后撤出動脈鞘,穿刺點縫合,逐層縫合皮膚,送回動物房喂養。術后予以青霉素300萬單位,繼續給予口服氯吡格雷37.5mg/d,拜阿司匹林100 mg/d,飼養到4周。

1.3 組織標本制備 支架置入術后4周對實驗犬實施處死.立刻分離靶血管,至少1 cm,包括支架置入部位的遠端及近端,10%甲醛溶液加壓灌注固定24小時,固定后環氧樹脂包埋切片,4-5μm厚切片,HE染色及彈力染色。

1.4 病理形態學分析 由計算機圖像系統分別測定內膜增生面積、管腔橫斷面積。內膜增生面積為原始管腔和狹窄管腔面積之差（原始管腔面積-狹窄管腔面積）,面積狹窄百分比由下列公式計算:面積狹窄百分比=100×[1-（狹窄管腔面積÷原始管腔面積）]。

2 結果

2.1 一般情況 所有動物支架均成功置入并存活至實驗終點。

2.2 涂層支架一般性狀 光學顯微鏡觀察涂層支架擴展時的順應性,支架直徑達到4mm時,涂層無明顯裂開、剝脫現象。

2.3 組織學檢測結果 造影結果顯示即刻植入后的支架血管比率、平均血管直徑,三組比較無明顯差別。支架置入4周后的狀況（表1及圖1）:三組管腔面積,雌二醇支架組最大,PLA組及裸支架組無明顯差異。雌二醇支架組內膜增生面積較裸支架組及PLA涂層支架組減低（P＜0.05）,PLA涂層支架組和裸支架組無明顯差別（P均＞0.05）。說明雌二醇支架加速內膜修復,可減少內膜過度增生。

表1 支架置入4 w后各組組織學檢測結果（±s）組別 例數 內膜增生面積（IA） 管腔總面積（TA） 面積狹窄百分比（%）雌二醇支架組 5 0.37±0.16* 4.91±0.38* 7.2±1.6*PLA涂層支架組 5 1.41±0.31# 3.90±0.43# 26.2±2.0#裸支架組 5 1.36±0.25# 3.98±0.61# 25.2±3.4#注:與PLA涂層支架組和裸支架組相比:*＜0.05;PLA涂層支架組與裸支架相比:#＞0.05

圖1 4 w后冠狀動脈橫斷面（HE染色,10×）

3 討論

冠狀動脈支架置入術后再狹窄一直是冠心病介入治療研究熱點。目前應用的藥物涂層支架如雷帕霉素與紫杉醇涂層支架,大大減少了再狹窄的發生率,但目前仍有5%左右再狹窄發生[3]。雷帕霉素與紫杉醇都是非平滑肌細胞選擇性藥物,在阻止平滑肌細胞增生的同時也阻止血管內皮細胞增生,使支架被內皮細胞覆蓋時間過長或難以被覆蓋,容易形成血栓。此外,在支架置入動脈部分可觀察到不同程度的慢性炎癥從而刺激內膜增生導致再狹窄[4]。2006年歐洲心血管年會引起會議巨大震動和關注的內容是關于藥物洗脫支架安全性的臨床試驗薈萃分析。長期隨訪結果表明,與金屬裸支架比較,藥物涂層支架置入后遠期血栓形成的風險比金屬裸支架增加了15%-35%,不但沒有降低總死亡率和心肌梗死的預后硬終點,反而有增加這些預后終點的趨勢[3-5]。相關檢查發現,其遠期血栓發生率增高的主要原因為支架表面內皮化不完全,部分支架裸露在血液中,而患者停用抗血小板藥物,使支架內血栓發生率明顯增高[4]。故由于存在上述缺點,導致冠脈內支架置入術后患者服用雙重或三重抗血小板藥物時間增長,從而增加了患者的醫療費用,增加了患者長期雙重抗血小板治療出血風險。而且長期內皮修復不完全,會刺激內膜增生導致再狹窄。故由于存在上述缺點,如何加速受損內膜修復的途徑來實現防治再狹窄這一目的,是一嶄新且極具前景的研究方向。

隨著基礎醫學研究的深入,目前普遍認為內皮損傷引起的瀑布反應是再狹窄的始動因素[6,7]。因此在抑制平滑肌增殖的同時,加速內皮損傷的修復更重要。同時加速內皮修復受損內膜可降低支架暴露于血液中時間,降低支架置入術后遠期血栓發生率,減少患者長期多重抗血小板治療的時間。最近的研究報道更新了我們對血管新生內膜形成的理解,血管新生內膜不僅可以從血管壁形成還可以由血液循環中前體細胞群形成,例如內皮前體細胞[7]。

內皮化的速度是影響內膜增生程度的一個重要因素。雌激素體外研究已證實雌激素能夠抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移,而作用于內皮細胞時則可促進其增殖和遷移[8,15]。研究證實雌激素可促進兔髂動脈球囊損傷后內皮細胞增殖,加快內皮修復并提高損傷內皮功能[11]。Krasinski[9]等的實驗發現雌激素能促進大鼠頸動脈球囊損傷區的再內皮化和內皮細胞功能的恢復。Strehlow[10]等發現雌激素能夠提高小鼠骨髓及外周血中內皮祖細胞數量,促進內皮祖細胞在損傷動脈處著床、生長,從而促使損傷血管內皮化。機械損傷是導致PCI術后血管平滑肌細胞大量增殖、遷移及分泌細胞外基質的主要原因。據報道血管損傷早期,雌激素能促進血管內皮細胞釋放NO、加速損傷血管的再內皮化;同時,雌激素還可抑制損傷局部的炎癥反應及損傷后血管平滑肌細胞絲裂素活化蛋白激酶的激活,通過這些途徑起到抑制新生內膜形成的作用[11-13]。上述研究初步證實17β-雌二醇洗脫支架安全、有效,具有良好的潛在臨床應用前景。

前期New[14]等采用磷酸膽堿包被支架攜帶17β雌二醇植入豬冠狀動脈,4周時17β雌二醇洗脫支架組較裸金屬支架組降低了40%的內膜增生。與new實驗結果相似,我們利用可降解高分子PLA作為載體,構建了生物可降解雌二醇洗脫支架,實驗中雌二醇支架組內膜增生面積比較裸支架組及PLA支架組減低,而裸支架組與PLA支架組無顯著差異,說明聚乳酸作為可降解載體具有良好的生物相容性,并沒有增加內膜增生,同時具有可降解功能,提高了支架的安全性。因為通過正常的機體代謝途徑,經過一定的時間,聚合物最終降解成小分子物質排出體外,沒有殘留,消除了潛在的聚合物對血管的不良反應可滿足支架載體要求。說明生物可降解高分子載雌二醇洗脫支架可通過加速內皮化,可減少內膜過度增生,防止再狹窄,為將來解決支架內再狹窄提供新的理念和方法。

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