胃動素對消化間期胃動脈血流影響的在體機制研究

金 穎,李 彤,劉 彤,金文香,金春香

（1.吉林大學白求恩醫學院,吉林長春 130021;2.吉林大學白求恩第二醫院;3.長春市朝陽區醫院;4.吉林大學白求恩第一醫院）

胃動素（Motilin）是啟動消化間期周期性胃腸移行性復合肌電運動（MigratingMotorComplex,MMC）的重要胃腸激素[1]。血中內生胃動素濃度在消化間期的波動特點與胃腸MMC緊密相關,顯示了靜止期（phaseⅠ期）的低谷和收縮期（phaseⅢ）附近的高峰[2,3]。胃腸MMC所具有的時相性和移行性特征,是人和哺乳動物與生俱來的基本運動形式[4],在整體生命活動中具有非常重要的生理意義,被稱為機械性胃腸“清道夫”,而且MMCⅢ相可發出“饑餓”信號,進而產生有意識的攝食欲望[4]。同時,胃動素還是啟動消化間期周期性膽囊收縮[5]和胰腺內[6]·外分泌[7,8]增加的主要激素之一,而且是與胃腸MMCⅢ相同步出現,促進化學性消化,因而也叫化學性“清掃”,為下一次進餐做準備。這些結果提示胃動素是聯系機械性和化學性消化的關鍵。我們課題組經在體研究,在國內首次報道了在支配胃腸的動脈系中,只有胃動脈發生消化間期周期性舒張并與胃腸MMCⅢ相同步出現胃血流的增加[9],而胃動素對消化間期胃動脈血流影響的在體機制目前在國內尚未見文獻報道。

1 材料與方法

1.1 材料

胃動素（Motilin）和VIP（vasoactive intestinal polypepdde,血管活性腸肽）從肽研究所（Minoh,Japan）購買;thya-milal購自 Kyorin（Tokyo,Japan）;halothane（氟烷）購自Takeda Chemical Industries（Osaka,Japan）;atropine（阿托品） hexamethonium（六羥季銨） propranolol（心得安）和 phenoxybenzamine（酚芐明）均購自Sigma公司;granisetron（5HT3受體拮抗劑）購自Roche（Tokyo,Japan）.GM-109（phe-cyclo[Lys-Tyr（3-tBu）-Ala-].trifluoroacetate）由Chugai Pharmaceutical（Tokyo,Japan）捐贈。

1.2 動物準備

在本研究中我們使用了健康成年狗5條,體重12.5-18.5 kg,雌雄均有,由名古屋大學醫學部動物管理中心提供。禁食18 h以后,對狗進行全身麻醉,然后進行腹部正中切開。超聲波傳輸時間血流儀的血流探頭（ultrasound transit-time blood flow meters;Transonic systems,Ithaca,NY）安裝固定在胃左動脈（LGA）周邊[10-13],與探頭相連的導線分別穿過腹腔,并通過人為制作的共用皮下隧道,最終固定在左側胸廓上。不銹鋼套管和托馬斯型十二指腸瘺管分別置入胃的體部和正對十二指腸乳頭的對側十二指腸腸壁上,另一端分別固定在左右側腹壁上[14]。最后縫合腹壁,關閉腹腔。遠距離血壓感應器測定系統（Data Science,St.Paul,MN）的導管被固定在股動脈里面。在手術期間始終以2 m l/min速度靜脈滴注生理鹽水。術后三天給予輸液和青霉素預防感染。一個月后痊愈,這一期間,狗可以自由地在籠里活動,并允許自由地攝入食物和水,除了實驗以外。

1.3 血流測定的穩定性

在手術之前校準血流探頭。每次實驗之前,為了探頭的穩定性、信號強度和電容,檢測了靜止期的脈沖和平均血流。LGA血流測定的可靠性在每條狗達12個月以上[10-13],未見有意義的差別。

1.4 實驗

禁食一夜（18小時）以后,狗在意識清醒的狀態下,站立于pavlov's臺上。首先打開胃和十二指腸的瘺管,把導管型應力傳感器（Millar,Houston,TX）分別固定在胃體和十二指腸瘺管內,并把其導線與polygraph系統相連,以便測定胃和十二指腸的機械性收縮運動。其次,把連接在血流探頭另一端的插頭與血流儀相連。通過polygraph系統（NEC-SanEi,Tokyo,Japan）測定LGA血流、胃和十二指腸的機械性收縮運動、血壓和心率,而且記錄在磁性的數據記錄儀（pen recorder;NEC-SanEi,Tokyo,Japan）。最終全部數據儲存在計算機數據調節掌握系統（Maclab system,Analog Digital Instruments,Castle Hill,Australia）。為了補充實驗中液體的流失,以1m l/m in靜脈內持續性滴注生理鹽水。

給每一條狗靜脈內持續性滴注生理鹽水至少達6小時。十二指腸的收縮期（phaseⅢ期）結束后30分鐘,靜脈內持續性滴注胃動素（100 pmol/kg/h）達30分鐘。十二指腸的收縮期（phaseⅢ期）結束后10分鐘,GM-109（10mmol/kg/h）、granisetron（40μg/kg/h）、atropine（50 μg/kg followed by 25 μg/kg/h）、hexamethonium（2 mg/kg followed by 5mg/kg/h）、phenoxybenzamine（1mg/kg）和propranolol（1mg/kg）分別靜脈內持續性滴注的前提下,反復靜點胃動素（100 pmol/kg/h）進行實驗。在另一個研究系列里,在有或無atropine（50μg/kg followed by 25 μg/kg/h）的情況下,把胃動素或VIP（5、10、20、40和80 pmol/kg）溶解在1 ml生理鹽水里,并在1分鐘內完成靜脈推注。實驗的全部系列被實施在5條狗上。每一條狗一周實驗1-2次,而且,一天只進行一個系列實驗。

1.5 分析

顯示的全部數據是15 s瞬間數據的平均值,來源于血流,心率,平均血壓及血管阻力,由計算機收集并儲存,用于數據分析。血管阻力（mmHg/m l per minute）通過系統平均血壓（mmHg）除以血流（m l/min）而獲得。計算出的血管阻力是注射后阻力與注射前阻力之比。通過總和30分鐘期間高于注射前水平的血流和胃腸腔內的阻力,分別計算血流增加的積分（m l/min·30minutes）和動力指數（motility index,反應收縮頻率和振幅總和,mmHg·30 minutes）。升高的LGA血流恢復到靜止水平的時間確認為靜止期的開始,把phaseⅡ收縮開始或血流升高開始的時間定為靜止期結束。

1.6 統計

所有的數據被表示為Means±SEM。通過方差分析進行統計學的分析,針對于配對數據進行配對t檢驗,而且針對于多重比較進行分散分析（Dunnett procedure）,P＜0.05為有意義的水平。

2 結果

2.1 胃動素對胃動脈血流的影響

胃動素誘導了LGA血流的增加,其類似于自發地發生的周期性LGA血流增加,并與胃·腸機械性收縮同步出現（圖1）。

2.2 胃動素受體拮抗劑GM-109對胃動素作用的影響

GM-109（10mmol/kg/h）的靜脈內持續性注入,完全抑制了胃動素（100 pmol/kg/h）誘導的LGA血流增加和胃·十二指腸的機械性運動（圖2）。GM-109靜脈內持續性注入達120min,完全抑制了自發性發生的周期性胃·十二指腸的運動和LGA血流的增加,而且當停止注入GM-109以后,立即出現了自發性發生的胃·十二指腸運動和LGA血流增加（圖3）。

圖1 胃動素（100 pmol/kg/h）靜脈內投入對胃·腸運動和LGA血流的影響

圖2 GM-109的前投入對胃動素作用的影響

圖3 GM-109（10mmol/kg/h）靜脈內投入對自發性發生的胃·十二指腸運動和LGA血流的影響

2.3 Granisetron對胃動素作用的影響

Granisetron（40μg/kg/h）完全抑制了胃動素（100 pmol/kg/h）誘導的胃運動,然而,這個 5-HT3受體抑制劑沒有抑制LGA血流的持續性升高和十二指腸的運動（圖4）。

2.4 Atropine對胃動素作用的影響

Atropine（25μg/kg/h）前投入的情況下,完全抑制了胃動素（100 pmol/kg/h）誘導的胃和十二指腸的收縮,然而未能抑制LGA血流的增加（圖5）。

圖4 Granisetron對胃動素誘導的胃·十二指腸運動和LGA血流的影響

圖5 atropine靜脈內前投入對胃動素誘導的胃收縮運動和LGA血流的影響

2.5 Hexamethonium對胃動素作用的影響

Hexamethonium（5mg/kg/h）,有意義的（P＜0.05）抑制了胃動素（100 pmol/kg/h）誘導的胃·十二指腸的運動,但無法抑制LGA血流的應答（圖6）。

2.6 腎上腺素能阻滯劑對胃動素作用的影響

Phenoxybenzamine（1 mg/kg）和Propranolol（1mg/kg）均沒有影響胃動素（100 pmol/kg/h）誘導的胃·十二指腸運動和LGA血流增加（圖7）。

2.7 胃動素的不同劑量與LGA血流應答

針對于胃動素（5、10、20、40和80 pmol/kg）不同劑量的靜脈內注射,無論LGA血流應答持續時間還是增加量都是相似的,均無劑量相關性（圖8A）。在atropine前投入的情況下,胃動素的靜注誘導了較小的但劑量相關的LGA血流的增加（圖8B）。用atropine處理以后,LGA血流對胃動素的應答仍然存在,但被GM-109完全抑制了,然而,VIP未受兩種抑制劑的影響（圖8C）。

圖6 hexamethonium靜脈內前投入對胃動素誘導的胃收縮運動和LGA血流的影響

圖7 GM-109（10 mmol/kg/h）,granisetron（GR;40μg/kg/h）,atropine（AT;25μg/kg/h）和 hexamethonium（C6;5 mg/kg/h）,Phenoxybenzamine（PHE;1 mg/kg）和 Propranolol（PRO;1 mg/kg）對 motilin（M;100 pmol/kg/h）誘導的胃·十二指腸收縮和LGA血流（積分）的影響。平均值±標準誤（n=5條狗）*代表有意義的差異（P＜0.05）與單獨使用motilin組比較

3 討論

圖8 Motilin（5,10,20,40和80 pmol/kg）靜注對LGA血流的影響無（A）或有（B）atropine（25 ug/kg/h）的情況。（C）前投入 atropine（25 ug/kg/h）和GM-109（10 mmol/kg/h）情況下LGA血流對motilin（M）或VIP 80 pmol/kg的應答

我們曾經在國內首次報道了在意識清醒狗消化間期支配胃腸的動脈系中,只有胃動脈發生周期性舒張并與胃腸MMCⅢ相同步出現胃血流的增加,外源性胃動素（生理劑量）,對腸系膜上動脈（SMA）、血壓和心率均沒有影響,胃動素只選擇性的舒張LGA增加胃動脈血流,且同步誘導MMCⅢ相類似的胃腸機械性收縮[9]。這些研究結果提示,消化間期隨著胃腸MMCⅢ相周期性的出現,只有胃對胃動脈血流的生理性需求同步呈現周期性的明顯增加。

本研究就胃動素選擇性舒張消化間期胃動脈增加胃動脈血流的在體機制進行了研究。其結果表明,胃動素對在體意識清醒狗消化間期胃平滑肌的調節機制與同步舒張胃動脈的作用機制是不同的,前者與膽堿能和非膽堿能神經關系密切,而后者以依賴于胃動脈壁上胃動素受體為主,膽堿能神經的參與為輔。

在這個研究系列里,靜脈內分別注射胃動素5-80 pmol/kg,LGA血流應答的持續時間和增加量是相似的,未見劑量相關性（圖8A）。Atropine的前投入,使LGA血流對胃動素的應答呈現劑量相關性,但明顯的小于單純胃動素投入組（圖B）。如此,胃動素誘導胃動脈舒張的機制,既有膽堿能神經的參與,也有對胃動脈壁的直接作用。胃動素作用的位置似乎在神經節后,因為與atropine相比,hexamethonium未能完全抑制胃動素誘導的胃收縮,而且,切除雙側迷走神經以后,Heidenhain囊仍然可以對胃動素產生應答[15]。實驗證明,胃動素刺激離體兔十二指腸的腸神經元釋放乙酰膽堿[16]。因此,胃動素很可能對胃壁內和腸壁內的固有膽堿能神經起作用,釋放的乙酰膽堿可以促進內皮釋放一氧化氮（NO）,并誘導胃動脈的舒張[17,18]。值得注意的是,胃動素是高度選擇性而且有效力的胃血管舒張劑。我們的研究顯示[9],胃動素誘導的胃血管舒張作用大于V IP。在5-80 pmol/kg劑量范圍內 胃動素沒有影響血壓,心率和SMA,然而VIP誘導了劑量相關的降低血壓 心動過速和SMA血流的增加。當通過atropine消除了膽堿能神經途徑參與的胃動素誘導的胃血管舒張部分后,兩種肽的劑量相關應答曲線幾乎是完全相同的。因此,胃動素本身就像VIP一樣是有效力的胃血管舒張劑,而且,此系列研究的最低劑量接近于胃動素的生理劑量。

對狗[19]和人[20]進行的實驗顯示,5HT3受體調節胃動素-或紅霉素誘導的胃收縮。周呂課題組曾發現,清醒狗胃腸MMC不同時相血漿胃動素和5-羥色胺（5-HT）濃度呈現周期性變化,5-HT峰值在胃動素峰值之前出現,表明5-HT激發了胃動素釋放,進而啟動MMCⅢ相[21],而且,胃腸MMC周期性調節是通過胃動素與5-HT間正反饋的相互作用機制實現的[22]。然而,這個途徑似乎在胃血管的調節機制中不重要,因為,5HT3受體拮抗劑granisetron,未能抑制胃動素誘導的胃動脈舒張（圖4,圖7）。交感神經系統在系統阻力血管的調節中起重要作用。在此研究里無論是α-還是β-腎上腺素能阻滯劑均沒有影響胃動素誘導的胃收縮和胃動脈舒張（圖7）。因此,腎上腺素能神經途徑在胃動素調控胃動脈舒張過程中不發揮作用。胃動素誘導的胃動脈舒張經 atropine的前投入仍然存在,而被GM-109完全抑制（圖8C）。GM-109敏感的胃動素受體有可能存在于胃動脈血管壁,并調控血管舒張,且胃動素通過內皮依賴機制直接或間接地作用于血管平滑肌上。胃動素-R1A受體被克隆[23]。組織化學的研究顯示,胃動素受體被表達在胃腸肌間神經元[24-26],但胃動脈壁上是否存在胃動素受體,尚有待進一步深入研究。我們的研究顯示,對于狗來說,胃動素是一個有效力的而且是高度選擇性的胃血管舒張劑。膽堿能神經途徑參與胃動素受體調控胃動脈舒張的過程。這個胃腸激素在消化間期胃血流的調節中起非常重要的作用,可以保護因消化間期胃收縮而引起的胃粘膜的局部缺血。這個假設的有效性和此發現的病理生理學的含義,尚有待繼續深入研究。

[1]Portras P.M otilin isa digestivehormone in the dog[J].Gastroenterology,1987,87:909.

[2]Ioh Z:Effect ofmotilin on gastrointestinalmotor activity in the dog[M].In:Itoh Z,ed.Motilin,Academic Press,San Diego,1990.133.

[3]張建忠,王 雁,袁申元.消化間期移行性復合運動的發生機制[J].胃腸病學和肝病學,1999,8:30.

[4]周 呂.消化間期移行性復合運動的重要性及其臨床意義[J].基礎醫學與臨床,1999,19:1.

[5]Itoh Z,Takahashi I.Periodic contractionsof the caninegallbladder during the interdigestive state[J].Am JPhysiol,1981,240,G183.

[6]Shiba Y,Mizumoto A,SatohM,et al:Effect of nonpeptidemotilin agonist EM 523 on releaseofgut and pancreatic hormones in conscious dogs[J].Gastroenterology,1996,110:241.

[7]Magee DF,Naruse S.The role ofmotilin in periodic interdigestive pancreatic secretion in dogs[J].JPhysiol,1984,355:441.

[8]Lee KY,Sniratori K,Chen YF,Chang TM,Chey WY.A hormonalmechanism for the interdigestive pancreatic secretion in dogs[J].Am JPhysiol,1986,251:G759.

[9] 劉賢英,李 彤,金 穎,金文香,金春香.消化間期意識清醒狗胃左動脈及腸系膜上動脈血流變化的對比研究[J].中國實驗診斷學,2011,15:397.

[10]Nakamura T,NaruseS,OzakiT,KumadaK.Calcitonin gene related peptide isa potent intestinal,but not gasiric,vasodilator in conscious dogs[J].Regul Pept,1996,65:21.

[11]Ito O,Naruse S,K itagawaM,Ishiguro H,Ko S,Nakajima M,Hayakawa T.The effect of V IP/PACAP family of peptideson pancreatic blood flow and secretion in conscious dogs[J].Regul Pept,1998,78:105.

[12]Jin C,Naruse S,Kitagawa M,Ishiguro H,NakajimaM,Mizuno N,Ko S,Hayakawa T.The effect of calcitonin gene-related peptide on pancreatic blood flow and secretion in conscious dogs[J].Regul Pept,2001,99:9.

[13]NakajimaM,NaruseS,Kitagawa M,Ishiguro H,Jin C.Ito O,Hayakawa T.Roleof cholecystokinin in the intestinalphaseof pancreatic circulation in dogs[J].Am JPhysiol,2001,280:G614.

[14]Magee DF,Naruse S.Neural control of periodic secretion of the pancreas and the stomach in fasting dogs[J].JPhysiol,1983,344:153.

[15]Magee DF,Naruse S.The role ofmotilin in periodic interdigestive pancreatic secretion in dogs[J].JPhysiol,1984,355:441.

[16]Kitazawa T,Ishii A,Taniyama K.The Leu 13motilin（KW-5139）evoked release of acetylcholine from enteric neurones in the rabbit duodenum[J].Br JPharmacol,1993,109:94.

[17]Furchgott RF,Zawadzki JV.The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterialsmoothmuscle by acetylcholine[J].Nature,1980,288:373.

[18]Palmer RMJ,Ferrige AG,Moncada S.Nitric oxide release accounts for the biologicalactivity of endothelium-derived relaxing factor[J].Nature,1987,327:524.

[19]Itoh Z,M izumoto A,Jwanaga Y,Yoshida N,ToriiK,WakabayashiK,Involvement of 5-hydroxytryptam ine 3 receptors in regulation of interdigestive gastric contractions by motilin in the dog[J].Gastroenterology,1991,100:901.

[20]Wilmer A,Tack J,CoremansG,Janssens J,Peeters T,Vantrappen G.5-hydroxytryptamine 3 receptors are involved in the initiation of gastric phase 3motor activity in humans[J].Gastroenterology,1993,105:773.

[21]楊春敏,周 呂,張 航,郝 維.5-羥色胺和胃動素在狗小腸移行性復合運動調控中的作用[J].生理學報,1998,50:431.

[22]Nakajima H,Mochiki E,Zietlow A,Ludwig K,Takahashi T.Mechanism of interdigestive migrating motor complex in conscious dogs[J].JGastroenterol,2010;45:506.

[23]Feighner SD,Tan CP,McKee KK,Paiyha OC,Hreniuk DL,Pong SS,Austin CP,Figueroa D,MacNeilD,Cascied MA,Nargund R,Bakshi R,AbramovitzM,Stocco R,Kargman S,O'NeillG,VanDerPloeg LHT,E-vans J,Patchett AA,Sm ith RG.Howard AD.Receptor formotilin identified in the humangastrointestinal system[J].Science,1999,284:2184.

[24]柳力公,周 呂,王 玲.腸神經系統腦腸肽神經元的免疫組化研究[J].基礎醫學與臨床,2003,23:348.

[25]楊 俠,董 蕾,楊 浩.大鼠腸肌間神經元胃動素受體的表達及胃動素引起神經元內鈣信號的機制[J].四川大學學報（醫學版）,2006,37:683.

[26]Hiroyuki O,M iki N,Katsuom i I.Molecular identification and characterization of the dogmotilin receptor[J].Regul Pept,2008,146:80.