12-脂氧化酶基因敲除對1型糖尿病腎病小鼠腎小球內纖維連接蛋白表達的影響

李龍鎬,陳 志,孫珉丹,尹 悅,李 佳,王婉寧,臧崇森,許鐘鎬*

眾多實驗研究均證實動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病腎病（Diabetic nephropathy,DN）等嚴重影響人類健康的疾病與白細胞型12-脂氧化酶（12-lipoxygenase,12-LO）的表達增加有密切的關系[1-4]。12-LO的激活在腎病的發生、發展過程中起著至關重要的作用[1,2]。腎臟細胞肥大和細胞外基質（Extracellular matrix,ECM）堆積是DN的特征性病變。早期研究證實了DN時12-LO主要通過介導細胞反應的重要信號通路—MAPK信號通路的一個途徑—p38 MAPK信號通路引起ECM堆積,而另外兩個MAPK信號通路—ERK和JNK信號通路無此介導作用[5-7]。然而,12-LO能否直接參與DN時腎小球細胞肥大過程,目前還不清楚。很多研究已明確纖維連接蛋白（Fibronectin,FN）是DN時腎小球肥大的標志性蛋白。本研究首次探討1型DN時12-LO基因敲除對腎小球內FN表達的影響,為12-LO在DN時腎小球纖維化過程中的作用提供最直接的依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 FN,β-actin抗體（美國Santa Cruz公司）,RNA STAT-60試劑（美國 Tel-Test Inc）,RT-PCR試劑盒、Taq DNA聚合酶和dNTP（德國 Boehringer Mannheim GmbH）,18S引物（美國Ambion Inc.）,免疫組織化學試劑盒（美國Dako Corporation）。

1.2 動物實驗 體重為22-25g的野生型和12-LO基因敲除C57BL/6小鼠（美國Jackson Laboratories）隨機分成4組:野生型對照組（n=8;WT）;12-LO基因敲除組（n=8;LOKO）;野生型糖尿病組（n=8;WT+STZ）;12-LO基因敲除糖尿病組（n=8;LOKO+STZ）。小鼠禁食12小時。模型組小鼠一次性腹腔注射STZ（200mg/kg,溶于pH4.2,0.1mol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液,冰浴新鮮配制）,48小時后經小鼠尾靜脈采血測血糖,以隨機血糖高于300mg/dL為糖尿病模型成功。對照組注射等量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。16周后處死動物。實驗結束前留取24小時尿,測血糖、稱重,乙醚麻醉小鼠,心臟取血,取出右腎稱重,采用系列過篩方法分離腎小球,在-70℃保管。

1.3 RT-PCR 取凍存的腎小球,用RNA STAT-60試劑一步法提取腎小球的總RNA。用RT-PCR試劑盒合成cDNA。逆轉錄體系包括1μg總RNA、10×PCR buffer,1 mmol/L dNTP,5mmol/L Mgcl2,0.5μg oligo（dT）,15U AMV逆轉錄酶,20U RNA酶抑制劑。反應條件為30℃10分種,42℃30分種,99℃5分種,5℃5分種。小鼠FN引物序列為:正鏈5′-GCACAACAGACCACCAAACTCG-3′, 反 鏈 5′-CTGAAGTCACTTCTCGGGGTGCG-3′,擴增片段大小 430 bp。PCR反應條件:95℃,預變性3分種,循環條件:94℃變性30秒,56℃退火30秒,72℃延伸1分種,循環結束后72℃延伸7分種,進行循環35次。最后各PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠（含0.5mg/L溴化乙錠）中電泳,于紫外線燈下拍照。為了半定量PCR產物,將膠片上反應條帶在圖像分析儀中掃描。

1.4 免疫組織化學檢查 石蠟切片常規脫蠟水化;1%H2O2作用15分鐘,PBS洗;0.05%胰蛋白酶液37℃作用30分鐘,PBS洗;10%正常山羊血清孵育15分種抑制非特異性結合;滴加FN一抗,4℃過夜,PBS洗;滴加二抗（生物素化兔抗鼠IgG）,37℃孵育30分鐘,PBS洗;滴加復合物（鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液）,37℃孵育30分鐘;DAB顯色,水洗后用蘇木素復染,透明封片。每批均設有陰性對照。

2 結果

2.1 動物的一般情況分析 與野生型對照組比較,野生型1型糖尿病小鼠血糖（P＜0.01）、腎重/體重比值（P＜0.01）和24小時尿白蛋白明顯增高（P＜0.01）,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠尿白蛋白（P＜0.05）、腎重/體重比值（P＜0.05）明顯低于野生型糖尿病小鼠,見圖1。

圖1 各組小鼠血糖、腎重/體重比值及24小時尿白蛋白的變化

2.2 RT-PCR結果分析 基礎情況下,野生型和12-LO基因敲除小鼠腎小球FN mRNA表達無差異。與野生型對照組相比,野生型糖尿病小鼠腎小球FN mRNA表達明顯增加（P＜0.01）,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠腎小球FNmRNA表達的增加（P＜0.05）,見圖 2。

2.3 免疫組織化學檢查分析 基礎情況下,野生型和12-LO基因敲除小鼠腎小球FN蛋白表達無差異。與野生型對照組相比,野生型糖尿病小鼠腎小球FN蛋白表達明顯增加,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠腎小球FN蛋白表達的增加,見圖3。

3 討論

圖2 各組小鼠腎小球內FN mRNA表達的變化

圖3 各組小鼠腎小球FN免疫組織化學檢查結果（×400）

12-LO是一種不飽和脂肪酸的氧合酶,它以花生四烯酸為基質生成相應的氫氧化二十碳四烯酸12-HETE。目前研究已證實12-LO及其代謝產物主要通過氧化應激反應和炎癥反應參與多種疾病的病理過程,如冠狀動脈粥樣硬化、高血壓、DN等[1-4]。近期的研究已明確12-LO、TGF-β和AngⅡ之間存在著相互協同作用[5-7]。12-LO通過p38MAPK信號通路引起腎小球ECM積聚,其作用在關于DN發病機制的研究中得到一些證實[5-7]。然而,12-LO是否直接參與DN時腎臟肥大及腎小球ECM積聚,目前尚無相關報道。

眾所周知,高糖在DN的發生和發展中起關鍵的作用。高糖是引起糖尿病合并癥的導火線。美國的1441例1型糖尿病病人的DCCT的前瞻性研究和英國對2型糖尿病的UKPDS研究明確地提出,嚴格控制血糖至接近正常水平可以有效地延緩DN的發生。Bleich和Han等的研究為糖尿病時抑制12-LO來保護胰腺β細胞而延緩血糖升高的設想提供了線索,其依據為:1）12-LO的代謝產物12-HETE破壞胰島β細胞的正常功能而降低胰島素的分泌[4];2）一些細胞因子通過12-LO的介導而破壞胰島β細胞的功能[4];3）COX-2的代謝產物—前列腺素破壞胰腺β細胞的功能,抑制12-LO可以減弱COX-2的表達,進而減少前列腺素的合成,從而阻止胰腺β細胞發生功能障礙[8];4）STZ誘導糖尿病的12-LO基因敲除的小鼠,其血糖在模型成功后一個月內明顯低于野生型糖尿病小鼠[3]。我們的研究發現,用STZ誘導糖尿病的12-LO基因敲除的小鼠,其血糖在模型成功后16周時仍低于野生型糖尿病小鼠,但統計學上無明顯差異。我們的結果證實通過抑制12-LO的活性可以阻止胰腺β細胞發生功能障礙而延緩血糖升高。

DN主要病理特征是腎小球細胞肥大、ECM堆積進而發生腎小球硬化。在本研究中,為了證明12-LO是否直接參與DN時腎臟肥大及腎小球ECM積聚,我們采用了12-LO基因敲除小鼠。基因敲除小鼠技術的建立和發展使得科學家們能夠從分子、細胞及動物整體水平研究特定基因在生物發育、生理以及病理中的作用,對生命科學的發展具有革命性的意義,對臨床疾病的認識和治療也起到了關鍵的推動作用。腎小球ECM的主要成分為IV型膠原、層粘連蛋白和FN。很多研究已明確FN是DN時腎小球肥大和ECM積聚的標志性蛋白。我們的研究證實,與對照組比較,糖尿病小鼠的腎重/體重比值明顯增高,但12-LO基因敲除糖尿病小鼠腎重/體重比值明顯低于野生型糖尿病小鼠,從而證明12-LO直接參與DN時腎臟肥大。病理學檢查和RT-PCR結果表明,與對照組相比,野生型糖尿病小鼠腎小球內FN明顯增加,但12-LO基因敲除可直接阻止糖尿病小鼠腎小球內FN表達的增加。本實驗結果表明,1型糖尿病小鼠腎小球內FN增加與蛋白尿的增加同步,但12-LO基因敲除可阻止糖尿病小鼠腎小球內FN增加與蛋白尿進展。總之,12-LO可直接誘導腎小球內FN的表達上調,加速DN腎小球肥大及DN的進展。因此,通過抑制12-LO來阻止糖尿病腎小球內FN的表達對延緩DN的進展具有重要的意義。

[1]Kang SW,Adler SG,Nast CC,et al.12-lipoxygenase expression is increased in diabeticnephropathy[J].K idney Int,2001,59:1354.

[2]Kang SW,Natarajan R,Shahed A,et al.Role of 12-lipoxygenase in the stimulation of p38mitogen-activated protein kinase and collagen alpha5（IV）in experimental diabetic nephropathy and in glucose-stimulated podocytes[J].JAm Soc Nephrol,2003,14:3178.

[3]Bleich D,Chen S,Zipser B,etal.Resistance to the type1 diabetes induction in 12-lipoxygenase knockoutmice[J].J Clin Invest,1999,103:1431.

[4]Bleich D,Chen S,Gu JL,et al.The role of 12-lipoxygenase in pancreaticcells[J].Int JMolMed,1998,1:265.

[5]Reddy MA,Adler SG,K im YS,et al.Interaction ofMAPK and 12-lipoxygenase pathways in growth and matrix protein expression in mesangial cells[J].Am JPhysiol Renal Physiol,2002,283:F985-994.

[6]Kim YS,Xu ZG,ReddyMA,etal.Novel interactionsbetween TGF-{beta}1 actionsand the 12/15-lipoxygenase pathway inmesangial cells[J].J Am Soc Nephrol,2005,16:352.

[7]Kim YS,Reddy MA,Lanting L,et al.Differential behavior of mesangial cells derived from 12/15-lipoxygenase knockout mice relative to control m ice[J].Kidney Int,2003,64:1702.

[8]Han X,Chen S,Sun Y,et al.Induction of cyclooxygenase-2 gene in pancreaticβ-cell by 12-lipoxygenase pathway product 12-hydroxyeicosateraenoic acid[J].MolEndocrinol,2002,16:2145.