來氟米特聯合貝那普利對糖尿病腎病大鼠腎組織MCP-1表達的影響

金 實,金 華,陳 瑛,李 燦,金海峰,崔鎮花

（延邊大學附屬醫院腎內科,吉林延吉 133000）

糖尿病腎病（DN）是常見的糖尿病微血管并發癥之一,其主要的病理改變是毛細血管基底膜增厚及系膜基質增生,最終導致腎小球硬化。目前DN的確切發病機制尚未完全闡明。近年的研究發現炎癥因子及促炎癥因子與DN的發生發展密切相關,并認為DN是一種炎癥性疾病[1]。MCP-1是單核/巨噬細胞特異性的趨化因子,在糖尿病腎病的發生、發展中起著很重要的作用,可趨化單核/巨噬細胞在腎組織的浸潤,與細胞外基質（ECM）的沉積、腎小球硬化密切相關[2]。ACEI主要通過阻斷血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的生成,阻斷腎素-血管緊張素系統（RAS）、抑制一系列炎癥因子的分泌,抑制或減輕DN炎性病理損害,故在DN的治療中已被臨床廣泛使用;來氟米特是一種新型的免疫抑制劑,可減少IgG免疫復合物在腎小球內的沉積以及DN大鼠腎組織中MCP-1的表達,起到保護腎臟的作用。兩者聯合應用可能更好地保護腎臟功能,延緩DN進展,為探討此可能性。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

來氟米特（商品名為愛諾華）由蘇州長征-欣凱制藥有限公司提供,貝那普利（商品名為洛汀新）由北京諾華制藥有限公司提供。鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司）,兔抗大鼠 MCP-1抗體、SABC免疫組織化學試劑盒（武漢博士得生物工程有限公司）。血糖儀（美國強生穩豪血糖儀及其配套試紙）,日立7600全自動生化分析儀。

1.2 動物與分組

取體重在180 g-200 g的Wistar雄性大鼠（由延邊大學醫學部動物科提供）40只,按晝夜時程平衡飼料喂養,自由飲水、進食,經1周喂養適應期后,測定血糖,均正常。禁食12小時后,隨機取10只大鼠作為正常對照組（NC,n=10）;其余30只大鼠,一次性腹腔注射STZ[4]（65 mg/kg,溶于pH4.5,0.1 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液,冰浴新鮮配制）,NC組注射等量的枸櫞酸鈉緩沖液。48 h后取大鼠尾尖血,測血糖值均≥16.7 mmol/L,DN模型成功。正常對照組血糖正常。將模型組30只大鼠隨機分成三組,即對照組（DN組,n=10）、貝那普利組（n=10）和貝那普利+來氟米特組（聯合用藥組,n=10）。造模成功第二天起,貝那普利組每天給予貝那普利（10mg/kg/d）灌胃,聯合用藥組每天給予來氟米特（10mg/kg/d）和貝那普利（10mg/kg/d）灌胃,NC組與DN組每天給予等量蒸餾水灌胃。

1.3 標本收集

在實驗第4周末、8周末、12周末,測體重;將大鼠置于清潔的代謝籠中,收集24小時尿,測量24小時尿蛋白排泄量（24 hUPE）、尿肌酐（Ucr）;乙醚吸入麻醉后,采用斷尾法采約2ml血,測血糖（Glu）、血肌酐（Scr）,計算內生肌酐清除率（Ccr）。由于Ccr受體表面積的影響,采用Ccr/體重（kg）加以校正。

Ccr（m l·min-1·kg-1）=尿肌酐（μmol/l）×每分鐘尿量（m l/min）/[血肌酐（μmol/l）·體重（kg）]

1.4 病理學檢查

（1）在實驗第12周末,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖開腹腔,取出腎臟,取2mm厚的腎組織,用10%中性福爾馬林固定,常規石蠟包埋,行PAS染色（過碘酸雪夫氏染色）和MCP-1免疫組化染色的光鏡樣品制備。（2）免疫組織化學染色（MCP-1）:切片厚 4μm,以酒精梯度常規脫蠟至水;含3%H2O2的甲醇室溫孵育10min,阻斷內源性過氧化物酶;高壓修復抗原;加入1∶100稀釋的兔抗鼠單克隆抗體,置濕盒中4℃過夜;1∶100稀釋生物素化羊抗兔IgG,37℃孵育25min;DAB顯色:1m l蒸餾水加入試劑盒中A、B、C試劑各一滴,混勻后加至切片,室溫顯色,鏡下控制反應時間5-10m in;蘇木素輕度復染細胞核,脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察腎組織細胞漿內有棕褐色顆粒者為陽性。每批均設有陰性對照。采用雙盲法在光鏡下隨機選擇20個腎小球/片,計數腎小球的陽性細胞數及細胞總數,MCP-1在腎小球細胞中的標記值為陽性細胞數/細胞總數。

1.5 統計學處理

數據采用SPSS11.5軟件進行統計學處理,數據均以均數±標準差（±s）表示,兩組間比較采用LSD-t檢驗,兩組以上比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）,P＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 不同時期血糖的變化

DN組、貝那普利組及聯合用藥組大鼠血糖較NC組明顯升高（P＜0.01）,且維持在較高水平上。DN組和貝那普利組及聯合用藥組大鼠之間血糖值相近,無顯著性差異（P＞0.05）（見表1）。

2.2 不同時期各組大鼠24小時尿蛋白排泄量的變化

DN組、貝那普利組及聯合用藥組大鼠24hUPE較NC組顯著升高（P＜0.01）,同期貝那普利組和聯合用藥組較DN組顯著降低（P＜0.01）,聯合用藥組較貝那普利組明顯降低,均有統計學意義（P＜0.05）。（見表2）

2.3 不同時期各組大鼠內生肌酐清除率的變化

表1 不同時期各組實驗大鼠血糖（mmol/l）比較（±s）分組 4w 8w 12w NC組 6.50±0.31 6.46±0.20 6.50±0.57 DN組 25.70±0.83* 24.73±0.92* 25.49±1.67*貝那普利組 24.81±1.06* 23.21±0.93* 24.20±1.15*聯合用藥組 24.48±1.07* 24.22±0.85* 24.68±1.16*注:*與對照組相比,P＜0.01

表2 不同時期各組實驗大鼠24hUPE（mg）比較（±s）分組 4w 8w 12w NC組 8.41±0.19 8.59±0.18 8.47±0.18 DN組 21.89±1.251） 28.18±2.041） 35.07±1.721）貝那普利組 17.31±1.411）3）19.29±0.801）2）22.06±0.651）2）聯合用藥組 13.24±1.501）2）4）14.11±1.261）2）5）17.50±0.951）2）5）注:1）與對照組比較,P＜0.01;2）與模型組比較,P＜0.01;3）與模型組比較,P＜0.05;4）與貝那普利組比較,P＜0.05;5）與貝那普利組比較,P＜0.01

DN組、貝那普利組及聯合用藥組大鼠Ccr較NC組顯著升高（P＜0.01）,貝那普利組及聯合用藥組較DN組顯著降低（P＜0.01）,聯合用藥組較貝那普利組更低,均有統計學意義（P＜0.05）。（見表3）

表3 不同時期各組大鼠 Ccr（m l·m in-1·kg-1）比較（ ±s）分組 4 w 8w 12 w NC組 3.52±0.45 3.38±0.30 3.39±0.21 DN 組 6.17±0.361） 5.85±0.141） 5.38±0.241）貝那普利組 5.13±0.231）2） 4.71±0.361）2） 4.20±0.131）2）聯合用藥組 4.74±0.321）2）3）4.42±0.921）2）3）4.01±0.171）2）3）注:1）與對照組比較,P＜0.01;2）與模型組比較,P＜0.01;3）與貝那普利組比較,P＜0.05

2.4 腎組織病理分析

（1）PAS染色:DN組表現為腎小球體積明顯增大、系膜基質增生、基底膜增厚等典型的DN病理表現。聯合用藥組與貝那普利組腎組織病理改變較DN組輕,腎小球體積有所縮小,系膜基質增生較DN組輕。聯合用藥組與貝那普利組相比,上述改變更輕。（見圖1）（2）免疫組化染色:MCP-1在腎小球內的表達:NC組在光鏡下腎小管著色,腎小球不著色或微量著色;DN組、貝那普利組及聯合用藥組,腎小球MCP-1表達顯著增加（P＜0.01）。（3）MCP-1表達半定量分析:與DN組比較,貝那普利組與聯合用藥組MCP-1陽性細胞數顯著下降（P＜0.01）;而聯合用藥組與貝那普利組比較,MCP-1陽性細胞數也明顯下降（P＜0.05）。（見圖2、表4）

表4 各組實驗大鼠腎臟MCP-1陽性細胞標記值比較（±s）NC組 DN組 貝那普利組 聯合用藥組MCP-1 0.02±0.01 0.46±0.051） 0.35±0.031）2） 0.23±0.031）2）3）注:1）與對照組比較,P＜0.01;2）與模型組比較,P＜0.01;3）與貝那普利組比較,P＜0.05

圖1 各組大鼠腎組織PAS染色（×400）

圖2 各組大鼠腎組織免疫組化（MCP-1）（×400）

3 討論

最近Katherine[3]提出把糖尿病腎病看作是一種由代謝紊亂引起的炎癥性疾病,在動物模型和人DN腎活檢標本中均發現有巨噬細胞在腎小球和腎小管間質中浸潤。DN組織中,多種炎癥介質、細胞因子、粘附分子以及趨化因子如TNF-a、MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1、骨橋蛋白（OPN）、巨噬細胞集落刺激因子等表達增多,NF-KB活性增加。糖尿病患者體內存在增強的炎癥反應并參與了糖尿病腎病的發生[4]。可見,炎癥反應和炎癥過程參與了DN的發生與發展,其重要作用不容小視。因此認為,用某種途徑抑制這些炎癥因子的表達,能夠延緩DN的發生和發展,從而為DN的抗炎治療提供了理論依據。

MCP-1是特異性的單核/巨噬細胞趨化因子,能促進單核細胞的移動和活化,在慢性炎癥的發病過程中起關鍵作用。研究發現MCP-1在糖尿病腎病的發生、發展中起著很重要的作用,可趨化單核/巨噬細胞在腎組織的浸潤,與細胞外基質（ECM）的堆積、基底膜增厚、腎小球硬化密切相關[2]。MCP-1由單核細胞、巨噬細胞、內皮細胞、成纖維細胞、腎小球系膜細胞等表達,其在生理情況下呈低水平表達,糖尿病時在高血糖、蛋白非酶糖基化產物、血管緊張素Ⅱ、氧化應激、炎癥和腎小球血流動力學改變等刺激因素影響下表達明顯上調[5]。在DN,由于高血糖刺激系膜細胞使MCP-1表達增多,MCP-1作為一種炎性細胞的趨化因子,誘導血循環中單核/巨噬細胞向腎內聚集、活化,活化的巨噬細胞能分泌TNFa、IL-6、轉化生長因子-β（TGF-β）及氧自由基（ROS）等炎性細胞因子和炎性介質,這些細胞因子通過自分泌和旁分泌的級聯作用,使這些細胞因子持續增高,趨化更多的炎癥細胞（如單核細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等）向腎內浸潤,使腎內炎癥持續。同時,細胞因子（如TNFa、IL-6、TGF-β等）刺激系膜細胞增殖,合成大量的Ⅳ型膠原、層黏蛋白（FN）等細胞外基質（ECM）成份,同時抑制ECM降解,導致ECM聚集,腎小球硬化,增高的細胞因子同樣能促使腎小管上皮細胞增殖,引起腎間質纖維化。本研究也證實DN時腎組織內MCP-1的表達明顯增加,而聯合應用貝那普利和來氟米特,明顯抑制了DN大鼠腎組織中MCP-1的表達,使腎組織病理改變及腎功能損害得到緩解,從而起到保護腎臟的作用,延緩DN進展。

ACEI主要通過阻斷AngⅡ的生成,阻斷腎素-血管緊張素系統（RAS）、抑制一系列炎癥因子的分泌,減輕或抑制DN炎性病理損害,故在DN的治療中已被臨床廣泛使用。已有實驗證實使用血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）能明顯抑制糖尿病腎小球MCP-l基因的表達,并伴隨蛋白尿的減少和腎小球中浸潤巨噬細胞數量的減少[6]。也有研究報道,貝那普利能減少MCP-1在DN大鼠腎組織中的表達[7],本文研究結果與此結論一致。

有實驗表明來氟米特能減少IgG免疫復合物在腎小球內的沉積,明顯減輕腎小球腎炎的病理表現[8]。本研究顯示聯合用藥組效果優于單用貝那普利組,說明兩者聯合應用可以更好地保護腎臟功能,延緩DN進展,為來氟米特在DN治療上的應用提供了理論依據。本研究中顯示聯合治療組和貝那普利組,均能使24hUPE、Ccr減少,而聯合治療組較貝那普利組更顯著。12周末腎組織病理顯示DN組腎小球體積增大,腎小球系膜增生,基底膜增厚;而聯合治療組和貝那普利組上述病理改變顯著減輕、MCP-1表達顯著下降,而且聯合治療組優于貝那普利組。說明應用免疫抑制劑來氟米特聯合ACEI貝那普利不僅抑制血管緊張素Ⅱ的生成,而且降低了腎組織內MCP-1的表達,從而減少單核/巨噬細胞在腎小球的廣泛浸潤,減少其導致的細胞外基質堆積及基底膜增厚,進而延緩腎小球硬化,最終達到延緩DN的發生發展。雖然本研究提示貝那普利聯合應用來氟米特可延緩DN發展,但貝那普利和來氟米特分別通過哪些作用機制來抑制MCP-1的表達有待于進一步研究。

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