膿毒癥大鼠腸道及腹水中菌群變化研究

劉大全,李東華,劉洪斌,宗春輝,高巧營

（天津市南開醫院中西醫結合急腹癥研究所,天津 300100）

膿毒癥（Sepsis）是創傷、燒傷、休克、感染、大手術后等臨床急危重病患者的常見嚴重并發癥之一,是感染引起的一種嚴重的全身炎癥反應綜合征（SIRS）[1-4]。另一方面,微生態學（microecology）是研究正常微生物群與宿主相互關系的生命科學分支,是微觀層次的生態學,即細胞或分子水平的生態學。而腸道微生態學研究的主要內容是腸道正常微生物群與宿主和環境構成的相互作用、相互制約的微生態系客觀規律。近幾年的研究成果證明,離開腸道微生態學,對消化道生理、病理學的研究其結論必定是不完整的,也是不科學的不準確的[5]。當機體發生腸穿孔、腹膜炎進而引起膿毒癥時,其胃腸道內的正常菌群必定發生相應的變化,致病菌本身或其代謝產物會參與全身的炎癥反應,繼而引起多器官功能障礙綜合癥（MODS）等嚴重后果。本研究運用熒光定量PCR和細菌培養的方法觀察病理狀態下動物模型腸道及腹水內的菌群變化情況,試圖從微生態的角度進一步闡述膿毒癥的發病機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,體重210-230 g,由中國藥品生物制品檢定所動物中心提供,動物合格證號SCXK（京）2005-0004。

1.2 主要試劑與儀器 糞便DNA提取試劑盒（QIAGEN美國）,普通PCR用Taq酶、熒光定量PCR試劑盒（均為北京天根生化科技有限公司）,細菌培養皿、細菌生化鑒定試劑盒（均為天津金章科技發展有限公司）,厭氧培養袋（梅里埃公司法國）;IQ5型熒光定量PCR儀（BIO-RAD美國）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 前期研究表明:盲腸結扎穿孔術后72 h動物模型的死亡率在50%-70%之間[6],故將Wistar大鼠60只,隨機分為假手術組（20只）、模型組（40只）。

1.3.2 模型制作 參照Wichterman等[7]的盲腸結扎穿孔（CLP）方法,實驗前12 h禁食、不限水,以10%水合氯醛按1 mL/kg劑量進行腹腔注射麻醉,無菌條件下開腹,分離盲腸,在距其末端2 cm處以1號絲線結扎,再用18號針頭在盲腸末端穿孔2處,將盲腸放回腹腔后逐層關腹。假手術組于分離盲腸末端時,不進行結扎、穿孔。

1.3.3 標本取材與處理 造模72 h后,各組動物在無菌條件下開腹,取腹水進行細菌培養（如動物腹腔內無腹水,則注入2ml無菌生理鹽水進行腹腔灌洗,然后取灌洗液進行細菌培養）,同時留取結腸內容物,使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3.4 腹水細菌培養 取500μl腹水（或灌洗液）作為原液,用無菌生理鹽水進行10倍的倍比稀釋,將不同濃度的菌液分別接種于需氧培養皿（包括血瓊脂培養皿、苯乙醇培養皿、麥康凱培養皿等）和厭氧培養皿上（厭氧培養皿放置于厭氧培養袋中）,分別在37℃培養箱內培養24 h和72 h。培養結束后選擇適當的稀釋度上生長的菌落進行鏡檢、耐氧試驗和微量生化反應試驗,以鑒定細菌的類型。

1.3.5 常規PCR反應 參照文獻[8]并結合使用引物設計軟件,針對雙歧桿菌、乳桿菌、大腸埃希菌、脆弱類桿菌和糞腸球菌的16SrRNA序列設計特異性引物（見表1）。PCR反應體系為25μl,其中DNA模板2μl,上下游引物（濃度為 25 pmol/μl）各 1 μl,10×Buffer2.5μl,dNTP 2μl,Taq 酶0.5μl,水16 μl。反應程序為:94℃變性4min后,94℃30 s,50℃（或55℃）30 s,72℃30 s共32個循環,最后以72℃10 min延伸后結束。經試驗摸索,大腸埃希菌、雙歧桿菌和脆弱類桿菌PCR反應的理想退火溫度為55℃,乳桿菌和糞腸球菌PCR反應的理想退火溫度為50℃。其擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

表1 5種細菌的引物序列和擴增片段長度

1.3.6 熒光定量PCR反應體系為 20μl其中DNA模板0.5μl,上下游引物（濃度為5 pmol/μl）各1μl,2.5×RealMasterMix和20×SYBR Solution的混合液9 μl,水8.5μl。反應程序為:94℃變性4 min后,94℃30 s,50℃（或 55℃）30 s,72℃30 s共40個循環,最后以68℃10min延伸后結束。

1.3.7 標準曲線的制作 參照文獻[8]的方法,取準確定量的細菌菌株作為標準品（為天津市南開醫院細菌室保存的質控菌株）做系列稀釋后,使其細菌濃度為105109拷貝/m L,并使用DNA提取試劑盒提取基因組DNA。以該DNA為模板進行熒光定量PCR。標準曲線以不同拷貝數的陽性模板的對數為橫坐標,以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數（Ct）為縱坐標繪制而成。待測樣品的PCR結果和標準曲線進行比較,即可獲得各待測樣品中5種細菌的具體數量。

2 結果

2.1 腹水細菌培養 模型組大鼠40只,造模72 h后仍存活的有23只,大多數個體有較多的腹腔滲出液,其性狀為淡黃色或淡粉色混濁半透明液體。假手術組全部存活,大多數個體無明顯的腹腔滲出液,收集腹腔灌洗液進行檢測。兩組動物腹水或腹腔灌洗液細菌培養結果見表2。另外,初次厭氧培養出的菌落經耐氧試驗篩選后證明全部是需氧菌和兼性厭氧菌,即兩組動物的腹水中沒有專性厭氧菌被檢出。

2.2 PCR產物電泳鑒定 PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳顯示5種細菌的16SrRNA擴增片段,見圖1。

表2 兩組動物腹水中細菌檢出率比較（百分率%）

圖1 細菌16SrRNA擴增片段電泳結果

2.3 熒光定量PCR標準曲線生成 以標準菌不同拷貝數的陽性模板的對數為橫坐標,以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數（Ct）為縱坐標繪制生成該菌的標準曲線,圖2為大腸埃希菌的標準曲線。

2.4 腸道菌群定量 通過熒光定量PCR反應,將待測樣品的檢測結果和標準曲線進行比較,獲得各樣品中5種細菌的具體數量。與假手術組相比,模型組腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的數量明顯減少（P＜0.01）,而大腸埃希菌的數量則有所增加（P＜0.01）,脆弱類桿菌和糞腸球菌的數量無明顯變化（P＞0.05）。圖3為大腸埃希菌熒光定量PCR反應曲線;兩組動物腸道菌群比較見表3。

圖2 大腸埃希菌的標準曲線

圖3 大腸埃希菌的熒光定量PCR反應曲線

3 討論

人類胃腸道表面所攜帶正常菌群的重量差不多有1千克,相當于最大消化腺-肝臟的重量,它們既參與機體代謝的全過程,又參與許多腸道毒物的分解、消化過程,與宿主健康狀態休戚相關。人的一生一般要經歷兩次正常微生物群的演替過程,第一次是從出生到第1-2周左右,腸道從無菌到有菌,形成具有嬰幼兒特點的腸道菌群;第二次演替是從乳喂養到混合喂養,腸道菌群會發生大的變動。成人腸道菌群是相對穩定的,一般因為患病或是用藥才會發生變動[9]。人類胃腸道約有300 m2的粘膜表面,種植著上萬種不同種群約1013-1014個細菌。在胃腸道不同部位,細菌的定植情況也不相同。胃內的正常寄生微生物包括鏈球菌、葡萄球菌、乳桿菌等,由于胃酸的抗微生物作用使得正常的胃內的大部分細菌被殺死,除了幽門螺旋桿菌外,其他的胃細菌僅僅在胃酸減少的患者中明顯可見。從小腸分離出的微生物種群有乳桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、類桿菌、韋榮氏球菌、葡萄球菌、放線菌屬、酵母菌、白色念珠菌、嗜血菌等。耐酸厭氧型革蘭陽性菌種控制著小腸上端部位,而越靠近遠端,革蘭陰性菌逐漸增加而占統治地位。大腸中隱匿有超過500種細菌種群,其中90%以上是專性厭氧菌,主要包括乳桿菌、鏈球菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌、丙酸桿菌、優桿菌、類桿菌、梭桿菌屬、韋榮氏球菌、葡萄球菌、酵母菌、放線菌、腸桿菌、腸球菌、糞球菌、消化鏈球菌屬等[10]。

本研究發現,模型組動物進行盲腸結扎穿孔后,其機體依次發生了不完全性腸梗阻、腸穿孔和腹膜炎等病理改變,其腸道內的正常菌群也發生了相應的變化,在正常狀態下占優勢地位的雙歧桿菌、乳桿菌等益生菌數量明顯減少,而大腸埃希菌的數量則有所增加。其中雙歧桿菌和乳桿菌均屬于腸道益生菌,它們參與構成腸道的正常防御系統。益生菌在腸道中發揮重要的生理作用,益生菌通過占據腸黏膜表面,提高上皮細胞的防御能力,還可以產生有機酸、游離脂肪酸、氨和過氧化氫,具有降低酸度并抑制或拮抗致病菌的作用。如雙歧桿菌及其表面分子能提高NK細胞和巨噬細胞活性,其代謝產物如小分子酸過氧化氫等活性物質形成化學屏障,阻止致病菌侵入和繁殖,進而提高局部或全身的抗感染能力。目前益生菌在治療醫學領域的應用面不斷擴大,可以應用益生菌進行治療的疾病包括:抗生素相關性腹瀉（AAD）、腸易激綜合癥（IBS）、炎癥性腸病（IBD）、幽門螺桿菌感染、各種便秘、結腸癌和高膽固醇血癥等[11]。

另一方面,在本研究中動物腹水細菌培養結果顯示:模型組大腸埃希菌的檢出率達到100%,說明大腸埃希菌是該模型大鼠主要的致病菌或致死菌。而鏈球菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、摩根氏菌和微球菌等檢出率也高于假手術組,上述細菌多數屬于條件致病菌,在正常的腸道中也是存在的,但數量有限并且與益生菌之間保持平衡狀態,當機體發生腸梗阻、腸穿孔、腹膜炎和膿毒癥時這種平衡被打破,條件致病菌則會在腸道、腹腔甚至在血液中大量繁殖,進而引起MODS甚至死亡等嚴重后果。

綜上所述,本研究在膿毒癥大鼠模型研究的基礎上,進一步對其腸道微生態結構進行分析,發現了膿毒癥大鼠與正常大鼠腸道菌群的結構變化,找出了導致膿毒癥大鼠患病甚至引起死亡的主要致病菌群。從一個新的角度解釋了膿毒癥的病理過程,也同時為達成有效降低膿毒癥死亡率這一全球的共同目標提供理論依據。

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