LRP6基因R611C的基因多態性與代謝綜合征相關性研究

王楠,劉 斌*,楊東輝,王 冠,史永鋒,張基昌,武軍鐸,張 濤

（1.吉林大學白求恩第二醫院心血管內科,吉林長春 130041;2.吉林省電力醫院）

代謝綜合征（Metabolic Syndrome,MS）是以中心性肥胖、糖尿病或糖調節受損、高血壓、血脂異常以及胰島素抵抗（insulin resistance,IR）為共同病理生理基礎,以多種代謝性疾病合并出現為臨床特點的一組臨床癥候群。越來越多的研究表明MS是缺血性心臟病的主要危險因素之一。AryaMani[1]于2007年發現在具有早發MS及冠心病特征伊朗一家族中LRP6基因第1973位堿基由C突變為T,引起了半胱氨酸（Cys C）替代了精氨酸（Arg R）,而第1973位堿基組成的密碼子對應的氨基酸為第611位氨基酸,當第1973位堿基為C時它所表達的氨基酸為精氨酸（Arg R）,而該為堿基為T時,它所表達的氨基酸為半胱氨酸（Cys C）,即LRP6基因Arg611Cys簡稱LRP6基因R611C。在此家族中有該基因突變的患者有高血壓、高血脂和糖尿病,并且他們有非常高的發生心臟病的風險。該家族一個重要的特征是,有基因突變的成員表現MS和早期冠心病,但無基因突變的成員則是正常的。本研究探討我國吉林地區漢族MS與LRP6基因R611C基因多態性的有無相關性。

1 實驗方法

2008年8月-2010年2月吉林大學第二醫院心內科患者均來自吉林省地區漢族人群194例。入院后身高、體重、腰圍、血壓,并空腹12小時采靜脈血由我院化驗科生化室檢測空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。分為（1）MS組（MS）（n=98）其中MS組包含血糖升高患者（＞5.6 mmol/L）（n1=58）、高血壓（BP＞140/90mmHg）患者（n2=66）、高脂血癥（n3=62）。（2）對照組（n=96）:其中血糖＜5.6mmol/L（n1=66）、血壓正常（n2=68）、血脂正常（n3=65）。

從基因文庫中調取的LRP6第1955位至2166位mRNA基因序列全長共211 bp即為PCR目的基因片段（詳見下圖）（genemap序號:gi|148727287|ref|NM002336.2|Homo sapiens LRP6）,mRNA）

ATAGACCTCAGGGCCTTCGCTGTGCTTGCCCTATTGGCTTTGAACTCATCAGTGACATGAAGACCTGCATTGTCCCAGAGGCTTTCCTTTTGTTTTCACGGAGAGCAGATATCAGACGAATTTCTCTGGAAACAAACAATAATAATGTGGCTATTCCACTCACTGGTGTCAAAGAAGCTTCTGCTTT GGATTTTGATGTGACAGACAACCG應用Primer5.0引物設計軟件進行引物設計,并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。（注:第1975位、1976位堿基為CT,在不影響PCR產物和酶切位點的情況下,為使CSP45Ⅰ限制性內切酶酶切,在設計上游引物時將第1975位、1976位堿基設計為AA,形成CSP45Ⅰ限制性內切酶的回文序列TT*CGAA）

上游引物:5'-ATAGACCTCAGGGCCTTCGAAGTGCTTGC-3',

下游引物:5'-GGATTTTGATGTGACAGACAACCG-3'

2.2.4 CSP45Ⅰ限制性內切酶酶切位點:（TT*CGAA）

5'… TTCGAA…3',

3'… AAGC TT…5'

2 數據處理

所有數據應用SPSS15.0統計軟件進行統計分析,計量資料以均數士標準差（±s）表示,計數資料以百分數表示,基因型和等位基因頻率采用基因計數法計算單個基因型,組間等位基因頻率比較采用四格表χ2檢驗和R×C列聯表 χ2檢驗,P＜0.05為有顯著性差異;通過病例對照研究,運用logistic回歸分析的方法,驗證各組基因型和對照組基因型之間的關系計算出比值比（odds ratio,OR）及95%可信區限（confidence intervals,CI）,以OR的95%CI不包含1為具有顯著性差異。

3 結果

3.1 MS組和對照組臨床資料及生化指標比較

MS組和對照組在年齡上無統計學差異（P＞0.05）,MS組與對照組在體重指數（BMI）、腰圍、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、血糖（GLU）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）上均有顯著統計學差異（P＜0.05）。

3.2 所得PCR產物分別用限制性內切酶CSP45I進行特定序列的酶切有三種電泳結果見圖1中2、3、4道。

3.2.1 當第1973位堿基C突變為T時則酶切后電泳應出現一條211 bp電泳條帶,此時基因型為CC型（圖1中2道）。

3.2.2 當第1973位堿基C不發生突變為T時則酶切后電泳應出現兩條條帶即194 bp與17 bp,由于17 bp的電泳帶與194 bp差距較大且Marker最小為200 bp,故17 bp電泳條帶觀察不到,只觀察到一條194 bp條帶,此時基因型為純合子RR型（圖1中3道）。

表1 兩組臨床資料及生化指標檢測結果

圖1 PCR擴增及CSP45I酶切后電泳圖

3.2.3 若酶切后電泳出現兩條條帶分別為211 bp與194 bp,17 bp電泳條帶觀察不到,211 bp條及194 bp條帶均較暗,則此時基因型為雜合子RC型（圖1中4道）。

3.3 各組LRP6基因R611C基因頻率表

表2 MS組和對照組LRP 6基因R 6 1 1 C基因頻率表

表3 血糖升高患者與血糖正常患者LRP6基因R611C基因頻率表

表4 高血壓患者與血壓正常患者LRP6基因R611C基因頻率表

表5 肥胖組和對照組LRP6基因R611C基因頻率表

表2、表3、表4、表5結果分析表明LRP6基因 R611C 基因多態性與MS、血糖升高、血壓升高、肥胖均無相關性。

表6 高脂血癥患者與血脂正常患者LRP6基因R611C基因頻率表

4 討論

代謝綜合征是一組由遺傳因素與環境因素共同決定的臨床癥候群,包括葡萄糖與胰島素代謝異常、肥胖（特別是腹型肥胖）、高脂血癥與高血壓。低密度脂蛋白受體相關蛋白6（low density lipoprotein receptor related protein6,LRP6）是 1998年被克隆出來的單跨膜受體[2,3],是LRP家族成員之一,LRP6基因近年來成為研究熱點之一,LRP6基因在人和小鼠之間具有極高的同源性,并且在果蠅中也存在對應的同源基因:Arrow[4,5]。人的LRP6基因在染色體上的位置為12p11-p13,mRNA為9 kb,相對應的蛋白質為 1613個氨基酸,具有信號肽和跨膜區,是I型單跨膜蛋白質。Arya Mani[1]于2007年發現在具有早發MS及冠心病特征伊朗一家族中LRP6基因第1973位堿基由C突變為T,引起了半胱氨酸（Cys C）替代了精氨酸（Arg R）。伊朗及美國大樣本MS人群研究并沒有發現這一基因突變。2008年日本學者Yukio[6]在對日本2型糖尿病患者研究中亦未發現與LRP6基因R611C基因多態性有相關性。本研究結果表明LRP6基因R611C與吉林漢族地區MS的發生無相關性,考慮LRP6基因R611C與MS相關可能只存在特殊遺傳家族中,也可能是LRP6基因R611C與MS的某一表型如血糖升高、高血脂、高血壓、肥胖等有關。有研究表明在小鼠中TCF7L2基因（也稱TCF4）是調節胰高血糖素樣肽-1分泌,與β-catenin共同作為 Wnt信號的轉導因子[7]。LRP6、TCF7L2的過度表達可以標記的肥胖鼠模型中增加高胰島素血癥和胰島素抵抗從而使胰島素的敏感性增加和脂肪細胞的減少,并最終導致血糖穩定的提升。但本研究結果未發現LRP6基因R611C與血糖升高相關。LRP6參與清除細胞內TG含脂蛋白進程,LRP6所在12p13區域包括TNFRSF和TNFRSF7基因,TNF受體家族成員明顯影響脂代謝和心血管的整體性。腫瘤壞死因子α（TNFα）和其他炎癥細胞因子的分泌被視為一個重要的肥胖相關的因素從而導致MS[8]。但LRP6是否與肥胖有關仍無確切研究。

目前LRP6基因R611C是否能引起高血壓及具體機制尚未報道,本研究發現與吉林漢族地區患者高血壓無相關性。SheidaMani等[9,10]2008年在小鼠上發現 LRP6基因 R611C控制的表皮生長因子受體（EGFP）突變同高膽固醇血癥和早發的動脈粥樣硬化相關,但它引起疾病的機制尚不清楚。SheidaMani等人推測LRP6基因R611C作用機制為LRP6突變受體在酸性環境中增加突變受體的親和力而導致在較晚的內吞體中LDL出現損傷分離,而這些內吞體能協調LDL與漿細胞膜之間循環,從而減低了對LDL清除作用,可引起引起MS的一個表型高脂血癥、高膽固醇血癥。研究表明LRP6基因R611C在小鼠實驗中可引起高脂血癥,本研究亦證實了LRP6基因R611C基因多態性與吉林地區漢族MS組中高脂血癥的發生具有相關性。目前關于LRP6基因R611C基因多態性的研究有一定的進展,但是LRP6基因R611C在MS病理生理中的確切機制及地位還需進一步證實。隨著其作用機制日益明確和研究深入,該基因有望成為MS治療的新的靶位點。

[1]Mani,A.Radhakrishnan,J.Wang,H.Mani,A.Mani,M.A,et al:LRP6 mutation in afamily with early coronary disease andmetabolic risk factors[J].Science,2007,315:1278.

[2]WehrliM,DouganST,CaldwellK,O KeefeL,SchwartzS,Vaizel OhayonD,Schej-terE,Tom linsonA,DiNardoS.Arrow encodesan LDL2 receptor2 related proteine ssen-tial for W ingless signalling[J].Nature,2000,407（6803）:527.

[3]Hey P J,TwellsRC,PhillipsM S,etal.Cloning of a novelmember of the

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[4]Brown SD,Twells RC,Hey P J,et al.Isolation and characterization of LRP6,anovelmember of the low density lipoprotein receptor gene fam ily[J].Biochem BiophysResCommun,1998,248（3）:879.

[5]WehrliM,Dougan S T,Caldwell K,et al.arrow encodesan LDL-receptorrelatedprotein essential for W ingless signalling[J].Nature,2000,407（6803）:527.

[6]Yukio Horikawa etal.Lack of Association of LRP5 and LRP6 Polymorphismwith Type 2 DiabetesMellitus in the Janpanese Population[J].Endocrine Journal2008:55（4）:699.

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[8]Gabriele E.Sonnenberg,et al.Genetic Determ inants of Obesity Related LipidTraits[J].Journal of Lipid Research,2007,22（11）:1126.

[9]Wenzhong Liu;MojganGharipour,etal.Lrp6Mediates Cellular Cholesterol Upta-ke[J].Circulation,2007,116:183.

[10]Wenzhong Liu,SheidaManiMutation in EGFPDomain of LDL Receptor Related Protein 6 Impairs Cellular LDL Clearance[J].Circulation Research,2008,103:1280.