非小細胞肺癌患者外周血循環內皮干細胞的檢測及其臨床意義

劉世國,陳 鵬,鄭 紅,嚴春潮,吳 瓊,龔 菲,岑千紅

（湖北省中山醫院檢驗科,湖北武漢 430033）

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一類來源于骨髓、增殖分化為血管內皮細胞的前體細胞。研究發現腫瘤靠血管新生來獲得其脈管系統,其機制是通過已有的毛細血管形成新生血管[1]。然而近年來的研究發現,腫瘤也可以通過骨髓來源的EPCs分化為成熟的內皮細胞后進一步形成腫瘤血管[2,3]。研究表明,血管內皮細胞的前體細胞內皮祖細胞在腫瘤機體內的含量明顯增高,其水平與活性與腫瘤的進展和治療相關。因此,這些內皮干細胞在腫瘤形成中的作用及腫瘤治療中的監測成為腫瘤研究的新領域。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集我院2008年9月至2009年8月期間非小細胞肺癌患者的外周血,采集血液標本時用EDTA抗凝管。其中,非小細胞肺癌患者組共45例,男性30例,女性15例,年齡53-84（61.3±7.5）,健康對照組15例。

1.2 實驗試劑

人纖維連接蛋白購于Chemicon公司;EBM-2培養基、SingleQuots組合添加劑購自Clonetics公司;Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）購于Molecular probes公司。ADMA,FITC標記荊豆凝集素I（FITC-UEA-I）,購于Sigma公司。PE-CD133,PEKDR購于德國MACS;TR IZOL購于晶美公司;optiL-yse C購于Sigma公司。

1.3 流式細胞儀檢測EPCs

在100μl含EDTA的外周血中加入Phycoerythrinconjugated anti-human VEGFR2（R&D systems）、或 biotin-conjugated anti-human CD133（Miltenyi Biotec）4℃反應30分鐘,然后加入2ml紅細胞裂解液處理20分鐘,用PBS洗滌。在CD133的反應管中繼續加入streptavidin-PECy5（BD Biosciences）反應30分鐘。同時取100μl的外周血加入相應熒光素標記的抗體作為同型對照,具體操作步驟同上。在1小時內用流式細胞儀檢測。

1.4 Real-time RT-PCR檢測EPCs標記分子

將外周血用紅細胞裂解液（Sigma,Munich,Germany）裂解15分鐘,離心后去掉上清,根據說明用Trizol reagent（Life Technologies）提取總RNA。其中逆轉錄反應體積為10μl,5xPrime Script Buffer 2μl,Prime Script RTEnzyme 0.5 μl,oligo dT 0.5 μl,Random 6mers 0.5 μl,total RNA 4 μl,加 RNase Freed H2O 至總體積10μl。37℃15min,85℃5 s。CD133上游引物序列為 5′-GCAATCTCCCTGTTGGTGAT-3′和下游引物 5′-CGCCTTGTCCTTGGTAGTGT-3′,VEGFR2 上 游引物序列為 5′-CACCACTCAAACGCTGACATGTA-3′和5′-GCTCGTTGGCGCACTCTT-3′。內參 β-actin 的上游引物為 5′-TCTGGCACCACACCTTCTAC-3′和下游引物5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 熒 光 定 量PCR反應體系總體積25μl,包括上游引物（10μmol/L）0.5μl,下游引物（10μmol/L）0.5μl,2xSYBR Premix Ex TaqTM 12.5μl,模板 cDNA 溶液2μl,反應條件經優化最后確定為:預變性95℃10 s,1個循環;95℃5 s,55℃20 s,72℃12 s,40循環。

1.5 內皮祖細胞分離培養及鑒定

取外周血2 0m l,注入已加EDTA的抗凝離心管,搖勻,4 h內處理標本。采集到的外周血20m lPBS對倍稀釋混勻。加入到淋巴細胞分離液。加入時小心與淋巴細胞分離液保持一界面,以2 000 r/min離心20min。離心后吸出灰白色的單個核細胞,小心吸取第二層乳白色液體于離心管中,并加以PBS液洗細胞,再以2 000 r/min離心3次。用吸管吸取上清,EGM-2 culturemedium（Clonetics Inc）,以2×106/ml濃度接種在用已用100μg/L纖維連接蛋白包被的6孔板中。第4天和第7天更換培養基。在培養細胞中加入5μg/m l的DiI-Ac-LDL,37℃孵育3小時,用PBS洗滌。用4%多聚甲醛固定細胞10分鐘。浸洗,將FITC-UEA-1（10mg/L）加于上述標本,于37℃下孵育1小時。在熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 非小細胞肺癌患者及健康人外周血EPCs的含量的檢測

雖然到目前對EPC還沒有明確的概念,根據最近幾年的研究,我們用流式細胞技術檢測CD133+和VEGFR2+表達情況,并把CD133+和VEGFR2+雙陽性細胞確定為EPCs（見圖1A）。在健康對照組中,外周血中EPCs的數量為（435±58.5）/ml,在非小細胞肺癌患者EPCs的數量為（1,365.4±225.6）/m l,相對于對照組大幅提高（P＜0.01）。

圖1 流式細胞術檢測外周血EPC數量

2.2 用real-time RT-PCR檢測EPC表面特異性標記分子

CD133和VEGFR2是EPC表面的特異性標記分子,為了進一步從RNA水平檢測其表達量,其相對表達量計算公式為:目的基因的相對表達水平=2-△△CT,△△CT=△CT（sample）-△CT（control）,△CT（sample）=CT（target gene）-CT（β-actin）。通過real-time RT-PCR檢測發現,非小細胞肺癌患者外周血中CD133mRNA水平是是正常對照的3.2倍（P＜0.01）。VEGFR2的mRNA水平是正常對照的4.5倍,（P＜0.01）。

2.3 EPCs的染色與鑒定

從患者外周血分離獲得的單個核細胞培養7 d后形成了梭形的內皮樣細胞。用acLDL-DiI和UEA-I對細胞染色后,通過共熒光顯微鏡鑒定,細胞攝取FITC-UEA-1后顯綠色熒光（圖3A）,發紅色熒光的為acLDL-DiI陽性細胞（圖3B）,acLDL-DiI和UEA-I雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs（圖3C）。

（P＜0.01,vs the controlgroup）圖2 外周血中CD133和VEGFR2的mRNA相對表達水平

A:EPCs combined with FITC-UEA-1;B:EPCs combined with Dil-acLDL;C:Mergeof FITC-UEA-1 and Dil-acLDL.圖3 EPCs的 Dil-acLDL和 FITC-UEA-1染色

3 討論

血管生成在腫瘤的進展中至關重要,當一個腫瘤組織生長達到一定體積時,其微環境已不能滿足腫瘤生長所需求的營養,此時會誘使腫瘤細胞啟動所謂的“血管形成開關”[4],通過促使原血管生成蛋白的表達,使原先存在的毛細血管擴散,導致新血管形成。有研究發現骨髓來源的外周血EPCs在腫瘤血管形成中發揮重要作用[5-7],最近有多組研究在人類腫瘤血管中發現了CD133的EPC,且多種腫瘤患者外周血中EPC的水平上升,如、肝癌[8]、乳腺癌[9]、淋巴瘤[10]等。故將EPC作為評估惡性腫瘤診斷和治療效果的一個可考慮應用的候選標志物。雖然對CEPs還沒有明確的定義,外周血中的血管內皮細胞及其前體細胞的鑒定,同樣借助于細胞表面的特異性標志。EPC表達內皮細胞的細胞標志物,如血管內皮生長因子受體 （VEGFR）,VE-cadherin、CD31、CD34、CD146等。目前較公認的 EPC為CD133+CD34+VEGFR2+細胞,而隨著EPC發育為成熟內皮細胞,CD133表達逐漸下降。因此,CD133是EPC獨特的細胞標志物,可以用于EPC與成熟內皮細胞的鑒別[11]。因此,我們選擇CD133、VEGFR2作為CEPs的表面標志。

本研究檢測了45例非小細胞肺癌患者及15例正常人外周血中的CEPs,通過用acLDL-DiI和UEA-I對細胞染色后,熒光顯微鏡檢測證實了外周血中CEPs的存在;流式細胞技術分析發現非小細胞肺癌患者CEPs含量高于正常對照組（P＜0.01）,為進一步證實非細胞肺癌患者外周血中CEPs含量的差異,我們用Real-timeRT-PCR檢測EPCs標記分子CD133和VEGFR2表達水平。其結果顯示,和正常對照組比較,EPCs標記分子表達量均有不同程度的增高。因此在監測和診斷非小細胞肺癌時EPC有可能作為一種新的輔助診斷工具,同時該研究為今后將EPCs作為預后和預測化療之后附加的抗血管治療效果的一個選擇性標記奠定基礎。

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