eNOS基因單核苷酸多態性與2型糖尿病合并高血壓相關性的研究

朱海超,于世軍,楊康鵑,朱玉琢*

（1.延邊大學基礎醫學院細胞生物學與遺傳學教研室,吉林延邊 133000;2.吉林大學白求恩醫學院 遺傳系,吉林 長春 130021）

2型糖尿病合并高血壓是臨床常見的問題,合并高血壓機率高達30%-50%[1]。患者一旦出現高血壓病,并發癥有加重的表現。研究結果表明2型糖尿病合并高血壓時在糖代謝異常及壓力負荷的雙重刺激下,加重了左心室心肌肥厚和功能受損。與單純高血壓比較,高血壓并存糖尿病患者的左心室及左心室重量增大及主動脈增寬,患者心臟結構和功能的異常較單純高血壓和2型糖尿病時更復雜和更嚴重,患者心腦血管疾病發生率明顯高于單純糖尿病組患者[2-4]。而降低糖尿病患者的血壓可以降低腦卒中發生率的35%-40%、心肌梗死發生率的20%-25%及心衰發生率的50%[5]。因此,尋找和建立有效的糖尿病合并高血壓發病風險預測和發病前診斷技術,在臨床上具有重要實用價值。本研究旨在探討吉林地區漢族人內皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因第7外顯子單核苷酸（G894T）多態性與糖尿病合并高血壓的關系,為臨床早期發現和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

本研究中所有2型糖尿病患者均來自吉林大學第一醫院的住院和門診患者,每個病人都根據1997年美國糖尿病協會（ADA）糖尿病診斷標準進行了嚴格的診斷。空腹血漿葡萄糖≥7.0mmol/L或隨機血漿葡萄糖≥11.1 mmol/L或OGTT試驗2小時血糖≥11.1mmol/L,符合上述標準之一者,在次日復診仍符合三條標準之一者確診為2型糖尿病患者。高血壓的診斷標準參照WHO的標準:收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90mmHg。有明確高血壓病史且長期服用降壓藥物者也包括在內。所有病例按照糖尿病病人是否患有高血壓分為兩組,單純糖尿病患者組和糖尿病伴有高血壓組。單純糖尿病組患者共有 45人,男/女=17/28,平均年齡 48±8.54歲。糖尿病合并高血壓組患者共有35人,男/女=13/22,平均年齡 51±7.46歲。正常對照組 36例,平均年齡47±8.44歲均來自吉林大學第一臨床醫學院藥理基地,均為吉林地區體檢的健康人。患者組與對照組均為吉林地區漢族人,各研究對象間均無血緣關系。所有入選患者的一般情況及臨床資料見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 血樣采集 所有受試對象均于晨起空腹取靜脈血2m l,2%EDTA抗凝。

1.2.2 基因組DNA的提取 采用DNA抽提試劑盒（Promega北京生物技術有限公司）快速抽提人外周血中白細胞基因組DNA,操作方法按說明書進行。

1.2.3 聚合酶鏈實驗 利用引物設計軟件Oligo6.0按照引物設計原則設計出引物。

eNOS基因第7外顯子894G→T位點引物:上游引 物:5′-CAAGGTGGAGAATGAGGAAAC-3′,下 游 引物:5′-CTTTAGAGGCTCAGGGATGGC-3′。 用 PCR 擴增儀,預變性為94℃,持續5min;繼之30個周期,每個周期中變性94℃持續1min;退火58℃持續2 min,延伸 72℃,持續2 min;循環結束后終末延伸72℃,持續10min。用BanII限制性內切酶消化擴增產物,反應采用20μl的反應體系。加樣完畢將上述反應液混合均勻,瞬時離心5 s。蓋好Eppendorf離心管,放入恒溫水浴鍋中,37℃水浴5 h。向管內添加10×loading buffer（含1%SDS）2μl,使內切酶變性以終止反應。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 用移液器取10μl酶切產物以2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。（在80 V電壓下泳動30min）,溴化乙錠染色,在透射式紫外線燈下觀察檢測結果。

1.3 統計方法

觀察熒光帶并確認讀取各樣本基因型,計算各組eNOS基因型頻率和等位基因頻率,然后經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。各組間等位基因頻率比較用χ2檢驗。用SPSS10.0 forwindows軟件處理數據。

2 結果

2.1 eNOS基因的各基因型鑒定 兩個位點不同等位基因的判別 894G→T位點:經過PCR擴增的產物得到430 bp,經過BanII內切酶酶切后得到312 bp和118 bp兩個片段,是野生型基因GG;酶切后產物既得到430 bp又得到312 bp和118 bp三條片段是突變型雜合子GT;酶切產物只得到一條片段430bp,是突變型純合子TT,結果見圖1。

圖1 eNOS基因第7外顯子894G→T多態位點 Ban II酶切后2%瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 基因型頻率和等位基因頻率比較 eNOS基因第7外顯子894G→T位點單純糖尿病組（DM組）,糖尿病合并高血壓組（DM+HP組）和對照組（NC組）基因型頻率和等位基因頻率分布,見表2。

表2 eNOS基因第7外顯子894G→T位點基因型頻率和等位基因頻率分布

3 討論

一氧化氮合酶（eNOS）是生成NO的限速酶。一氧化氮合酶（eNOS）基因位于人染色體的7q35～q36區,長約21kb,包括26個外顯子和25個內含子。現已證實的eNOS基因的多態位點有10個。包括:兩個微衛星序列,兩個串聯重復序列,6個單核昔酸多態性位點。本研究關注第7外顯子單核苷酸（G894T）多態性多態性。

國內外對eNOS基因G894T多態性與原發性高血壓的關系存在著巨大的差異。而對eNOS基因G894T多態性與糖尿病合并高血壓的研究很少。本研究按有無高血壓分為糖尿病合并高血壓組（DM+HP）和單純糖尿病組（DM）時,基因型的分析揭示DM+HP組（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）較NC組（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%.）分布有明顯差異（P＜0.05）,T等位基因頻率亦有顯著差異（DM+HP組等位基因頻率分別為G型為72.9%,T型為27.1%NC組中等位基因頻率分別為G型為87.5%,T型為12.5%）而DM組（GG型66.7%,ID型28.9%,DD型4.4%）與DM+HP組（GG型51.4%,GT型42.9%,TT型5.7%）和NC組（GG型83.3%,GT型8.3%,TT型8.3%）無明顯差異（P＞0.05）。T等位基因比較也是沒有差異（P＞0.05）。

[1]Sowers JR,Ep steinM.Diabetesmellitusand associated hypertension,vascular disease,and nephropathy:an update[J].Hypertension,1995,26（8）:869.

[2]張立權,丁紹平,胡東升.2型糖尿病合并高血壓患者左心室結構和功能變化[J].嶺南心血管病雜志,2007,13（6）:214.

[3]周方明,祝之明,譚建聰,等.高血壓合并糖尿病患者心臟結構與功能的變化特點[J].中國糖尿病雜志,2002,10（4）:199.

[4]白 璐,喬 晶,高曉虹,等.2型糖尿病合并高血壓對心腦血管疾病的影響[J].中國誤診學雜志,2007,6（3）:1201.

[5]Chobanian AV,Bak ris GL,Black HR,et al.Seventh Report of the joint NationalCommitteeon prevention,Detection,Evaluation,and Treatmentof High Blood Pressure[J].JAMA,2003,289（12）:2560.