卵巢漿液性囊腺癌與交界性囊腺瘤的差異蛋白質組學分析

張立會,王宏宇,劉紅燕,聶建國

（1.吉林大學第二醫院,吉林 長春 130041;2.根河市滿歸中心衛生院,內蒙古根河 022363）

卵巢惡性腫瘤發生率在女性生殖系統腫瘤中占第3位,低于宮頸癌和子宮體癌,但死亡率卻最高。其中40%-50%為卵巢漿液性囊腺癌（Ovary serous cystadenocarcinoma,OSC）,最為常見。由于卵巢位置深在盆腔,早期癥狀不典型或無明顯癥狀,且缺乏早期有效可靠的診斷、治療及預后評價方法,這就使得卵巢癌的早期診斷率不高,70%的患者初診時已是晚期,預后差,5年生存率僅為20%左右;而在早期發現者經過常規手術和化療,5年生存率可達90%。因此,篩選特異、敏感的腫瘤標志物對卵巢癌的早期診斷和預后具有重要意義。

蛋白質組是指一個細胞、組織或機體的基因組所表達的所有蛋白質。蛋白質組學是對蛋白質組整體水平進行研究的一門新型技術。蛋白質組學（proteomics）技術已達到細胞及亞細胞器蛋白質組分析水平,可徹底闡明細胞所有的蛋白質組分。使尋找用于臨床早期診斷的特異敏感的生物學標志物成為可能[1]。在卵巢癌的多方面研究中得到廣泛的應用,如對卵巢癌發病機制的研究、卵巢癌腫瘤標志物（tumor marker,TM）的篩選、卵巢癌信號轉導通路的研究及協助診斷、協助卵巢癌分類、尋找治療靶點等。研究卵巢癌的發病機制、分類、治療方法,尤其是早期診斷（early diagnosis）,具有十分重要的意義,而與傳統方法相比,蛋白質組學在腫瘤各方面研究中具有十分獨特的優勢。

1 材料與方法

1.1 病例選擇 本研究選取吉林大學第二醫院婦科2008年4月-2008年12月收治的臨床上初次手術治療并經病理確診的卵巢漿液性囊腺癌患者6例（以下稱CA組）,卵巢交界性漿液性囊腺瘤6例（以下稱IN組）,已告知患者取組織學標本用途,并同意取材。手術標本均在30分鐘內置于-80℃低溫冰箱內保存。CA組年齡范圍為42-75歲,病理類型均為卵巢漿液性囊腺癌,臨床病理分期均為IIIc期。

1.2 實驗方法 把保存好的標本融化,放在無菌的培養皿中用磷酸鹽緩沖液沖洗,去除黏附的血紅蛋白和其他蛋白。然后把組織切成1mm3大小,放入液氮中研磨粉碎。再用裂解液溶解,同時加入DNA酶和RNA酶去除DNA和RNA。然后在100,000 g條件下離心1小時去不溶解成分。所有樣品用Bradford方法測定蛋白濃度后置-80℃保存。酶切前所有樣品用25mM NH4HCO3稀釋使尿素濃度低于2M。酶切時首先用20mM DTT在56℃條件下還原1小時,再在常溫下避光用50mM碘乙酰胺烷基化30分鐘,然后按 1∶50比例加入測序級胰酶37℃酶切過夜。酶切后樣品真空抽干后-80℃保存備用。所有樣品用緩沖液A（0.1%甲酸）溶解后,應用二維液質聯用技術（two dimensional liquid chromatography mass Spectrometer/mass Spectrometer,2-DE LC-MS/MS）進行分析,每次實驗上樣量為50μg。強陽離子柱為150mm×0.32mm,反相柱為150mm×0.17mm,強陽離子柱的乙酸氨洗脫方法為12.5mM,25mM,50mM,75 mM,250mM和5M。反相柱洗脫方法為5-30%緩沖液B（0.1%甲酸,99.9%乙腈,流速為2 μL/m in）,洗脫時間為3小時。每個樣品做兩次實驗。經反相色譜洗脫的多肽應用LTQ XL質譜儀檢測,質核比檢測范圍為400-2000 amu,應用數據依賴方式進行次二級質譜掃描（每次全掃描后做10次二級掃描,母離子質核比寬度為3 amu,35%標準碰撞能量,動態排除時間為1.5min）。

1.3 數據處理 強度在10個單位以上、有10個以上離子信號的譜圖用SEQUEST算法和相關Bioworks 3.3.1 SP1軟件包進行數據庫檢索,鑒定出相關多肽和蛋白。蛋白數據庫為從歐洲生物信息學院網站（http://www.ebi.ac.uk/IPI/）下載的人蛋白質數據庫（3.58版）。相關檢索參數如下:多肽質量誤差范圍為3 Da,半胱氨酸修飾為+57,完全酶切肽段,可以有兩個誤切位點。SEQUEST檢索后篩選參數如下:（1）Rsp=1;（2）在假陽性率為1%時,DeltaCn＞=0.2,Xcorr值在單電荷時為1.7,雙電荷時為3.2,三電荷時為3.3。

1.4 結果判定 本研究應用兩次實驗中每個蛋白的譜圖數來評價其豐度。對于在不同樣品中豐度發生變化的蛋白,其譜圖數變化必須滿足以下原則:（1）兩個樣品中譜圖數的比值大于等于2。（2）兩個樣品中譜圖數的差值大于等于24（平均每次實驗差值為12）。為評價上述方法用于鑒別蛋白豐度變化的假陽性率,每個樣品的兩次實驗之間進行了相互比較分析,相應假陽性率為1.4%。

2 結果

2.1 1D-PAGE結果 將為CA組、IN組的混合樣品酶切前后分別進行1D-PAGE（如圖1）,得出結果兩組間及酶切前后電泳條帶均有有差異,一方面說明這兩個樣品是有差異的,另一方面說明本酶切效率比較好,酶切后的肽段都在分子量10 KD以下。對酶切后樣品進行液質聯用圖譜分析。

圖1 CA組、IN組的混合樣品酶切前后1D-PAGE結果

2.2 質譜分析結果 從CA組、IN組的組織標本取得的2個混合樣品,液質聯用分析都進兩次實驗。綜合兩次實驗結果,CA組織蛋白共計1 085個;IN組織蛋白共計585個。兩次實驗得出的譜圖數是相近的,說明本方法具有很好的重復性。根據差異蛋白判定原則,計算得出CA-IN組差異蛋白數為96個。

CA-IN組鑒定得出的96個差異蛋白譜中,有83個差異蛋白表達上調;13個差異蛋白表達下調。這些差異蛋白主要包括細胞骨架蛋白、伴侶蛋白、細胞外基質蛋白、參與物質及能量代謝的酶類、信號轉導、細胞周期、轉錄及翻譯相關蛋白、免疫調節因子以及其他參與卵巢癌發生、發展、轉移相關蛋白。蛋白分類構成情況如圖2。

其中16個蛋白為細胞骨架成分,12個蛋白為伴侶蛋白,12個蛋白為細胞外基質的組成成分,25個為參與物質及能量代謝的酶類,3個參與信號轉導的蛋白分子,18個參與細胞周期、轉錄及翻譯相關蛋白,4個免疫相關蛋白以及其他6種蛋白質。

3 討論

由于卵巢癌早期缺乏特異的臨床表現和有效的篩查方法,I期就明確診斷的患者僅僅占25%。因此卵巢癌的早期診斷在提高卵巢癌患者生存率上顯得尤為重要。

目前CA125是應用最為廣泛的上皮性卵巢癌檢測標志物,在晚期上皮性卵巢癌中陽性率可達80%,但Ⅰ期卵巢癌患者僅50%-60%,單測CA125時其陽性預測值＜10%,輔助超聲檢測只有20%左右,因此不能用于卵巢癌早期診斷的常規篩查。

本實驗采用二維液質聯用技術鑒定了6例卵巢漿液性囊腺癌和6例卵巢交界性漿液性囊腺瘤組織的差異表達蛋白質譜。為了降低實驗的假陽性率,兩個實驗樣品分別做兩次,綜合兩次實驗結果,根據差異蛋白的判定原則鑒定出96個唯一/成組差異蛋白。按照蛋白功能不同分為8類,其中一些蛋白與卵巢癌和（或）其它惡性腫瘤的關系比較明確,參與細胞間或細胞內生物信號轉導、免疫調節,促進腫瘤細胞的惡性增殖,加速腫瘤的發生、發展和轉移,在腫瘤發生發展過程中在不同時相、部位起著重要的作用。尚有其他一些差異蛋白與卵巢癌的關系尚未明確。

圖2 差異蛋白粉類構成

3.1 細胞骨架蛋白

細胞骨架是指真核細胞中的蛋白纖維網絡結構,由微絲、微管和中間纖維構成。本實驗鑒定出3種肌動蛋白（胞質肌動蛋白、人肌動蛋白素-1、骨骼肌肌動蛋白-1）,參與細胞的有絲分裂、信號傳導和細胞的運動,它的異常表達可能與腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲有關[3]。7種微管蛋白鏈（微管蛋白 α-1A 、β 、β-2A 、β-2C 、β-3 、α-4A 、A1B cDNA FLJ60097）,是 中心體的重要組成部分,參與染色體的運動、有絲分裂和細胞凋亡等。tubulin A、B蛋白正常排列的破壞及表達異常與腫瘤的惡性生物學行為密切相關,其數量及形態在腫瘤細胞中均發生了變化,微管的聚合及解聚與惡性腫瘤的發生及增殖有關。2種網格蛋白（網格蛋白-1、網格蛋白重鏈-1）形成參與細胞內吞的包被外殼和主要支架。3種肌球蛋白（肌球蛋白14重鏈3亞型、肌球蛋白-9:1亞型、肌球蛋白11）,肌球蛋白在胞質分裂、細胞形態和某些功能如細胞分泌有重要作用,是決定細胞形態和功能的因素之一。

3.2 伴侶蛋白

是細胞受刺激后被誘導產生的一組應激蛋白。除熱損傷外,能由多種損傷因素誘導,具有維持細胞蛋白自穩、調節細胞周期等多種重要功能。本實驗鑒定出10種HSP分型,（HSPA5、HSP 71 kDa、HSPA1B;HSPA1A 70 kDa、HSP 27kDa 、HSP60 kDa、HSP90-beta、HSP90B1:內質網素、HSPA1L 70 kDa 、泛素樣活化酶-1、缺氧上調蛋白1（Hypoxia up-regulated protein 1,HYOU1）。有證據表明HSP家族可能通過抑制細胞凋亡來導致腫瘤形成[4]。

HSP27是一種與致癌作用明顯相關的HSP亞型,在多種惡性腫瘤中高度表達,包括生殖系統腫瘤。卵巢癌患者對Hsp27免疫應答增強。因此HSP27-抗HSP27抗體的凝集試驗可能成為卵巢癌早期診斷的有用參數。HSP70在正常細胞中表達水平較低,而在應激狀態下可顯著性升高。在病毒轉化和化學誘導的腫瘤細胞中,HSP70的表達顯著升高;并且對細胞凋亡有保護作用,其高表達可增強腫瘤細胞抗凋亡能力。可提示上皮發育不良或惡變[4]。HSP90的抑制劑具有抗增殖和促進細胞凋亡的作用,有望成為癌癥化療藥。HYOU1在局部缺氧缺血和血管形成中有重要作用,在侵襲性前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌中表達增加,與淋巴管及淋巴結侵襲等因素有關,認為HYOU1可能在腫瘤轉移中起作用,并可提示預后不良。PDI是一種胰臟特有的糖基化蛋白質,可導致蛋白質折疊錯誤。本實驗鑒定出PDI的A3亞型PDIA3。PDIA3是一種惡性腫瘤高遷移率蛋白,參與DNA片段破壞,可能成為新的化療藥物靶點[5]。

此外,PHB基因可能是一種抑癌基因,具有抗增殖活性。Jean等[6]應用蛋白質組學技術在TOV-112D卵巢癌細胞系發現PHB呈高表達。

3.3 細胞外基質

細胞外基質（extracellu larmatrixc,ECM）是腫瘤轉移的組織屏障。惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移常常伴有細胞外基質及其細胞表面受體表達的變化。

本實驗鑒定出12種ECM類蛋白,其中膠原蛋白包括XIV型膠原蛋白α-1、VI型膠原蛋白α-3及它的3種前體。VI型膠原a-3的分布與腫瘤分化程度有關,隨著分化程度的下降而減少,可能與腫瘤細胞通過蛋白水解酶降解基底膜有關。

糖蛋白在惡變細胞中,其結構或含量發生改變。

FN在子宮內膜癌中表達降低,與其侵襲、轉移關系密切,有望成為子宮內膜癌進展指標[7]。FN分布與腫瘤分化程度有關,分化差的癌巢周圍缺乏FN,可能與癌細胞分解基底膜有關。

VTN參與卵巢癌轉移的起始階段。VTN與整合素α（v）連接并相互作用促使卵巢癌細胞增殖及轉移。VTN主要在肝臟合成,分布在正常卵巢上皮表面及分化的卵巢腺癌,在未分化腺癌組織中則不表達。VTN與腫瘤的侵襲與轉移有關,并可能有助于病理分型。

CLU作為凋亡抑制因子,在許多腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用。Hough等[8]應用cDNA芯片檢測發現,卵巢癌細胞中Clu基因的mRNA表達明顯上調,可能與卵巢癌的發生、發展相關。SPON1在卵巢癌上皮表達,而正常卵巢中無表達,認為是一種潛在診斷的卵巢癌腫瘤標記物和新的治療靶點。

POSTN可能是一種有力的腫瘤促進劑,與其他基質蛋白協引起腫瘤發生。這一過程先于腫瘤發展,成為潛在的診斷早期腫瘤的標志物[9]。

FMOD使腫瘤間質增厚,增加細胞間隙液壓。給腫瘤細胞與血液之間建立屏障。可成為靶向治療的位點,提高實體惡性腫瘤化療療效。

DCN可以抑制多種組織來源的細胞生長。應用免疫組化法及WESTERN-BLOT法未在卵巢癌中檢測到DCN,推測可能是在 DCN轉錄合成后被卵巢癌上皮細胞分泌酶類滅活[10]。

3.4 參與物質及能量代謝的酶類

本實驗發現物質能量代謝相關蛋白共有25種,主要包括糖酵解酶類、電子轉移的輔酶、合成蛋白質酶類、ATP合成水解酶和GTP合成水解酶、核酸代謝相關酶類等。這些酶類的高表達符合惡性腫瘤代謝特點,在腫瘤診斷及治療方面有重要的作用。

Altenberg等[11]認為糖酵解途徑相關基因在超過70%的人類腫瘤病例中過表達。糖酵解異常活躍是惡性腫瘤物質能量代謝的主要特征。

秒表時間研究法是一種最直接和較為可靠的研究工序作業時間的方法，就是用秒表對工序按照操作順序進行測定，測得多個周期時間之后，再求平均時間，作為單個周期的時間。這其實是一種抽樣法，就是用樣本推測總體，所以，對于每個工序需要測量多少組數據，才能較為合理，這非常重要。這里主要介紹誤差界限法：

其中線粒體蘋果酸脫氫酶是三羧酸循環和天冬氨酸-蘋果酸穿梭體的重要組成部分;三羧酸循環中的一些重要酶類可能作為藥物的靶標,或用于發展疫苗。

本實驗鑒定出2種與核酸代謝有關的蛋白質。包括DNA依賴蛋白激酶催化亞基、葡萄球菌核酶區包含蛋白。其中DNA依賴蛋白激酶催化亞基,具有DNA水解酶功能。

3.5 信號轉導相關蛋白

粘液病毒抗性蛋白（Interferon-induced GTP-binding protein,Mx1）屬于大GTP酶的動態蛋白超家族,是由STAT信號傳導通路介導,由Ⅰ型IFN誘導的跨膜轉運蛋白,具有廣譜的抗病毒能力。SAMHD1具有跨膜結構。K-sam是成纖維細胞生長因子受體家族成員,50%彌漫型胃癌存在K-sam的過表達。彌漫型胃癌中K-sam基因擴增與腫瘤的進展和轉移是有一定的聯系[12]。STAT1除介導正常細胞信號傳導外,在腫瘤的發生、發展中起著十分關鍵的作用。許多腫瘤STAT途徑存在異常,導致細胞轉化、凋亡抑制。

3.6 細胞周期、轉錄及翻譯相關蛋白

我們鑒定出參與細胞周期、轉錄、翻譯及調控的蛋白有18種。

組蛋白對染色質的組裝和結構形成起到重要作用。本實驗鑒定出7種組蛋白亞型。磷酸化組蛋白H2AX是DNA雙鏈斷裂的標志物[13],組蛋白H 1.3表達下調,它在染色質的包裝和活化方面具有非常重要的作用,對轉錄具有抑制作用。抗磷酸化組蛋白-H 3抗體可標記細胞增殖分裂相;組蛋白類修飾與許多基因表達下調有關,其中包括很多在惡性腫瘤發生發展過程中起關鍵作用的基因。

過氧化物酶基因（peroxiredoxin-1,PRDX1）,參與基因轉錄調控及信號轉導,是一種腫瘤抑制基因。

14-3-3蛋白（14-3-3 protein zeta/delta,YWHAZ）是一種銜接蛋白,Sinha[14]等應用雙向電泳法研究耐藥的人類黑素瘤細胞系,發現14-3-3蛋白δ的高表達干擾伴侶蛋白系統,影響轉錄機制,進一步研究有助于開發更有效的化療藥物。

本實驗檢測出4種EEF亞型:硫脲嘧啶-轉運體線粒體前體、EEF1A1、EEF1B2和延長因子 2。其中硫脲嘧啶翻譯延長因子在多種腫瘤中廣泛存在并高度表達。CTSD是一種肽鏈內切酶,與多種惡性腫瘤的浸潤和轉移有密切關系。hn-RNPs可成為調節端粒長度的標靶[15]。核不均一核糖核蛋白M,核不均一核糖核蛋白C1/C2,在本實驗中表達上調。其中hnRNPC1/C2是細胞核中含量最大的蛋白質之一,影響細胞增殖與分化。hnRNPM4,又被稱為癌胚抗原受體,位于巨噬細胞膜于與癌胚抗原結合后通過激活信號轉導途徑逃避細胞凋亡。

3.7 免疫調節因子

免疫抑制及免疫逃避是惡性腫瘤的發病機制之一,也是腫瘤免疫療法研究的熱點。本實驗發現4個免疫相關因子。

TAP1與鼻咽癌的發病有關。小劑量非復制腺病毒編碼的TAP1可誘導T細胞記憶,進而對腫瘤進行免疫應答[16]。

GC屬胞外射線清除系統,該蛋白存在于多種惡性腫瘤中,如乳腺癌,結腸癌,胰腺癌,前列腺癌等[17]。有研究認為該蛋白與絕經后婦女低乳腺癌風險有關。

A1BG屬于免疫球蛋白超家族成員,是一種分泌血漿蛋白。Kreunin等人[18]使用糖蛋白檢測方法,在膀胱癌病人的尿的樣品中發現A1BG,但是在正常個體未檢測到。A1BG是一個與腫瘤相關基因,可能是一種潛在的腫瘤標記物。

IGHV3是一種免疫球蛋白重鏈片段,其多態性與大皰性類天皰瘡易感性有關。表達非突變狀態IGHV的多毛細胞白血病對克拉屈濱呈低反應性,使病情惡化[19]。

3.8 其他腫瘤相關蛋白

A2M是一種血漿蛋白同時也是一種廣譜的蛋白酶抑制劑。它具有抑制腫瘤生長參與出凝血平衡和清除循環中內源性及外源性蛋白水解酶等重要生理功能。

本實驗鑒定出三種亞型FGA、FGB和FGG均表達上調。卵巢癌患者磷酸化FGA血清水平提高[20]。FGB可抑制內皮細胞對ECM的粘附,間接地抑制血管形成,推測其可能具有抗腫瘤效應。FGG同樣具有抑制血管形成及腫瘤生長的功能。

綜上所述,我們的實驗將二維液質聯用技術應用到卵巢癌的研究中,這一方法便利、高效、重復性好;在樣品的選擇上,卵巢漿液性囊腺癌組織與卵巢交界性漿液腺瘤組織進行對比,有望發現癌形成初始過程中關鍵的致癌因子,有利于卵巢癌發病機制的探索,特異性的卵巢癌腫瘤標志物篩選。研究結果表明:二維液質聯用技術是有效可行的,將有助于我們簡便快捷地篩選腫瘤標志物,可以從整體上闡述卵巢腫瘤發生發展過程中蛋白質的動態變化及相互作用網絡,必將對探索卵巢癌的發病機制做出巨大貢獻;應用于臨床,對卵巢癌的診斷、治療及預后評估有重要意義。

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