IL-23p19 mRNA在RA患者滑膜組織及滑膜細胞中的表達*

趙文君 邢國勝 于順祿 魏學磊 張 凱 陸 蕓 郭 剛

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種進行性的關節炎性破壞，以滑膜增生及關節軟骨和骨破壞為特征的系統性自身免疫病。慢性炎癥過程及細胞因子引起的自身免疫過程可誘發關節破壞。白細胞介素（IL）-23是新近發現的細胞因子，主要由活性單核巨噬細胞和樹突狀細胞分泌，具有十分復雜的生物學功能。本研究旨在檢測RA患者滑膜組織、RA滑膜成纖維細胞(synovial fibro?blasts，SF)中IL-23p19 mRNA的表達，并與骨性關節炎(osteoporosis arthritis，OA)滑膜組織、OASF中IL-23p19 mRNA相比較，并分析RA患者滑膜組織、RASF中IL-23p19 mRNA與IL-1β mRNA的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有滑膜組織均來源于2008年10月—2009年9月天津醫院關節科行滑膜切除術及關節置換術的患者，其中RA患者6例，男2例，女4例，年齡51～61歲，平均（54.0± 3.5）；OA患者6例，男1例，女5例，年齡54～77歲，平均（63.7± 7.9）。診斷符合美國風濕學會1987年修訂的RA診斷標準及1986年制定的OA診斷標準，并經術后病理學證實。所有患者均無腫瘤以及其他與免疫相關的疾病。術中無菌切取的滑膜組織分兩部分：一部分用于SF體外培養，一部分液氮保存用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 SF體外培養 DMEM和胎牛血清均購自Gibco公司。無菌切取的滑膜組織，Hank’s反復沖洗，去除表面的滑液。修剪成1 mm3左右的小塊，置于0.25%胰酶，37℃消化30 min，棄上清，在剩余組織塊中加入1 g/LⅡ型膠原酶，37℃消化2 h。200目紗網過濾，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM重懸細胞，接種于培養瓶內，置37℃，5%CO2細胞培養箱內培養。待細胞擴增至一定濃度，常規消化，傳代培養。

1.2.2 RNA提取及RT-PCR Trizol購自invitrogen公司，逆轉錄相關試劑及PCR相關試劑均購自TaKaRa公司，DNA Marker為DL2000。取液氮中凍存的滑膜組織約100 mg及培養的第2代SF，分別加入1 mL Trizol，提取步驟按試劑盒說明進行。實驗中所用耗材均經過無RNA酶處理。取RNA 4 mg，oligo(dT)181 μL，加DEPC水補足至5 μL，70℃孵育5 min，取出迅速置于冰盒內，按順序加入5×RT buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，反轉錄酶1 μL。42℃孵育1 h，95℃，5 s，-20℃保存，用于PCR反應。PCR反應總體積25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，TaqDNA聚合酶0.25 μL，三蒸水18.25 μL，模板1 μL。循環參數：95℃3 min變性，95℃1 min，56℃40 s，72℃1 min，最后延伸72℃7 min，35個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 PCR產物結果分析 取10 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，EB染色。凝膠自動成像分析系統掃描成像，并測定條帶灰度值，以目的基因與內參基因GAPDH比值作為目的基因相對表達量。

1.3 統計學處理 采用SPSS 10.0統計分析軟件，計量資料描述用M（P25,P75），2組間比較采用秩和檢驗，相關性采用Pearson直線相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RA與OA患者滑膜組織中IL-23p19 mRNA的表達 6例RA滑膜組織在260 bp處均表達明亮、清晰的特異性條帶，6例OA滑膜組織中有4例在260 bp處表達較弱的特異性條帶；RA滑膜組織中的表達量為0.306 5（0.244 0，0.380 5），明顯高于OA滑膜組織中陽性標本的表達量0.125 4（0.117 5,0.134 0），差異有統計學意義（T=10,P＜0.05），見圖1。

圖1 RA與OA組織IL-23p19 mRNA擴增產物電泳結果

2.2 RASF與OASF中IL-23p19 mRNA表達 RASF中6例均在260 bp處表達明亮、清晰的特異性條帶，OASF中4例在260 bp處表達較弱的特異性條帶。RASF中陽性表達量為0.287 0（0.251 5，0.310 7）明顯高于OASF中的0.087 9（0.021 5，0.134 2），差異有統計學意義（T=10,P＜0.05），見圖2。

圖2 RASF與OASF中IL-23p19 mRNA擴增產物電泳結果

2.3 IL-1β mRNA在RA滑膜組織與RASF中的表達及與IL-23p19 mRNA的相關性 6例滑膜RA組織和6例RASF在233 bp處均表達明亮、清晰的IL-1β特異性條帶，見圖3。在RA滑膜組織中IL-23p19 mRNA的表達量與IL-1βmRNA的表達量0.127 0（0.078 6，0.411 4）呈正相關（r=0.900，P＜0.05），RASF中IL-23p19 mRNA的表達量與IL-1β mRNA的表達量0.083 5（0.063 8，0.115 4）呈正相關（r= 0.883，P＜0.05）。

3 討論

圖3 RA滑膜組織與RASF中IL-1βmRNA擴增產物電泳結果

IL-23主要來源于一些抗原提呈細胞，如激活的樹突狀細胞，被革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及病毒產物刺激后的單核細胞和巨噬細胞等。IL-23可刺激Th17細胞分泌前炎癥細胞因子IL-17[1]，而IL-17也可刺激IL-23p19亞單位的生成[2]，該作用通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、細胞核因子（NF）-κB和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路發揮作用[3]。IL-23、IL-17A和IL-17F在T細胞觸發的炎癥中發揮著重要作用，如RA、多發性硬化癥和系統性紅斑狼瘡等免疫性疾病，這些因子可上調另外一些參與炎癥反應的細胞因子和化學因子的分泌。Brentano等[4]對滑膜組織進行原位雜交，結果顯示RA滑膜組織有大量的IL-23p19 mRNA表達，OA滑膜組織不表達或微量表達。本研究結果顯示，6例RA患者滑膜組織中均有IL-23p19 mRNA的表達，主要由于RA滑膜組織中含有大量的免疫炎性細胞，包括淋巴細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等，激活的單核巨噬細胞和樹突狀細胞能分泌大量的IL-23p19。同時，筆者發現體外分離培養的RA患者滑膜成纖維細胞也均表達IL-23p19 mRNA。Brentano等[4]認為體外培養的RA滑膜成纖維細胞在沒有刺激因素存在的情況下是不表達IL-23p19 mRNA的，這可能是由于他們選擇的是4～8代滑膜細胞，細胞分化程度與體內有所不同；而本研究使用的第2代細胞，更接近于體內細胞狀態。本研究中，6例OA滑膜組織和OASF中的4例表達IL-23p19 mRNA，且所有陽性標本的相對表達量也明顯低于RA患者。這是由于OA患者滑膜組織中也存在少量的淋巴細胞、單核巨噬細胞等炎性細胞，但明顯少于RA患者，炎性表現較弱，而OA滑膜成纖維細胞由于在體內受到較少的炎性細胞刺激，其表達IL-23p19 mRNA會相應地減少或減弱。

激活的嗜酸性粒細胞、樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞能分泌前炎癥細胞因子IL-1β。RA中高表達的IL-1β參與免疫反應的啟動，介導關節軟骨的破壞降解及骨破壞。IL-1β作為前炎癥細胞因子有利于中性粒細胞在組織中的浸潤，在RA免疫反應的啟動中發揮重要作用。IL-1β通過抑制基質的合成在關節軟骨的降解中發揮關鍵作用。除此之外，IL-1β在介導免疫性疾病外周組織的破壞中發揮重要作用。RA滑膜組織與RASF中兩者均呈正相關，表明RA的發病過程中IL-23與IL-1β的分泌存在密切關系，IL-23很可能也通過IL-1β發揮其在RA致病中的作用。

本研究發現IL-23p19 mRNA在RA患者滑膜組織、SF中的表達量明顯高于OA患者，這與兩者的發病機制及滑膜炎癥的病理表現不同有關。IL-23很可能是RA發病過程中重要的促炎因子之一，并且除了在滑膜組織中的單核巨噬細胞、樹突狀細胞等炎性細胞表達外，SF也能表達；RA滑膜組織與RASF表達的IL-23p19 mRNA與IL-1β mRNA的表達呈正相關關系表明SF分泌的IL-23也參與了RA的發病過程，除通過調節IL-17的分泌外，調節IL-1β的分泌很可能是其發揮作用的方式之一。這種致炎因子的多來源性及作用方式的多樣性在RA免疫啟動和放大中發揮重要作用。

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[4]Brentano F,Ospelt C,Stanczyk J,et al.Abundant expression of the interleukin(IL)23 subunit p19,but low levels of bioactive IL23 in the rheumatoid synovium:differential expression and Toll-like re?ceptor-(TLR)dependent regulation of the IL23 subunits,p19 and p40,in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis,2009,68(1): 143-150.